PRECURSORES DE INSULINA Y PROCESO PARA SU PREPARACION.
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0200190DK.
Solicitante: NOVO NORDISK A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: NOVO ALLE,2880 BAGSVERD.
Inventor/es: KJELDSEN,THOMAS,BOERGLUM.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 16 de Septiembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/62 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Insulinas.
Clasificación PCT:
- C07K14/62 C07K 14/00 […] › Insulinas.
- C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
- C12P21/02 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Precursores de insulina y proceso para su preparación.
Antecedentes
Organismos de levadura producen varias proteínas que tienen una función fuera de la célula. Proteínas de este tipo son referidas como proteínas segregadas. Estas proteínas segregadas se expresan inicialmente dentro de la célula en una forma precursora o una forma pre conteniendo una secuencia de prepéptido que asegura la dirección (translocación) eficaz del producto expresado a través de la membrana del retículo endoplásmico (ER). El prepéptido, normalmente denominado un péptido señal, es generalmente seccionado del producto deseado durante la translocación. Una vez introducida en la vía secretora, la proteína se transporta al aparato de Golgi. Del Golgi, la proteína puede seguir diferentes vías que llevan a compartimentos tales como la vacuola celular o la membrana celular, o puede ser dirigida fuera de la célula para ser segregada al medio externo (Pfeffer a al. (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:829-852).
La insulina es una hormona polipeptídica segregada por ß-células del páncreas y consiste en dos cadenas de polipéptido, A y B, que se enlazan por dos puentes disulfuro de intercadena. Además, la cadena A caracteriza un puente disulfuro de intra-cadena.
La hormona es sintetizada como una proinsulina monocatenaria precursora (preproinsulina) que consiste en un prepéptido de 24 aminoácidos seguido de proinsulina que contiene 86 aminoácidos en la configuración: prepéptido - B - Arg Arg - C - Lys Arg -A, donde C es un péptido de conexión de 31 aminoácidos. Arg-Arg y Lys-Arg son sitios de seccionamiento para el seccionamiento del péptido de conexión de las cadenas A y B.
Tres métodos más importantes han sido usados para la producción de insulina humana en microorganismos. Dos implican Escherichia coli, bien con la expresión de una proteína de fusión grande en el citoplasma (Frank et al. (1981) in Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, IL. pp 729-739), o uso de un péptido señal para permitir la secreción en el espacio periplásmico (Chan et al. (1981) PNAS 78:5401- 5404). Un tercer método utiliza Saccharomyces cerevisiae para segregar un precursor de insulina en el medio (Thim et al. (1986) PNAS 83:6766-6770). La técnica anterior expone un número limitado de precursores de insulina que se expresan en bien E. coli o Saccharomyces cerevisiae, véase US 5,962,267, WO 95/16708, EP 0055945, EP 0163529, EP 0347845 y EP 0741188.
Resumen de la intención
La presente invención caracteriza nuevos péptidos de conexión (Péptidos C) que confieren un rendimiento de producción aumentada de moléculas de precursor de insulina cuando se expresa en un microorganismo transformado, en particular levadura. Precursores de insulina de este tipo pueden después ser convertidos en insulina humana, insulina humana desB30 o determinadas insulinas humanas aciladas por una o más fases de conversión adecuadas bien conocidas.
Los péptidos de conexión de la presente invención contienen al menos un Pro y generalmente serán relativamente cortos, normalmente no más largos de 6 - 4 residuos de aminoácidos de longitud.
El péptido de conexión contiene un sitio de seccionamiento en su extremo C-terminal que permite el seccionamiento in vitro del péptido de conexión de la cadena A. El sitio de seccionamiento permitiendo el seccionamiento del péptido de conexión de la cadena A es un residuo de aminoácido único básico Lys o Arg, preferiblemente Lys que es divisible por tripsina o tripsina como proteasas; la proteasa Acromobactor lyticus o por una proteasa de carboxipeptidasa.
El seccionamiento del péptido de conexión de la cadena B se habilita por rotura en el residuo de aminoácido LysB29 natural en la cadena B que da lugar al precursor de insulina desB30. Si el precursor de insulina debe ser convertido en insulina humana, el residuo de aminoácido B30 Thr (Thr) puede después ser añadido por procedimientos enzimáticos bien conocidos, in vitro. La insulina desB30 puede también ser convertida en una insulina acilada como se describe en US 5,750,497 y US 5,905,140.
En una forma de realización los precursores de insulina según la invención comprenden la fórmula B(1-29) - X1 - Y - A(1-21), donde X1 es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es Pro, y Y es Lys o Arg.
En otra forma de realización de la presente invención el Pro es inmediatamente N-terminal al sitio de rotura Y contiguo a la cadena A. El péptido de conexión puede contener más de un Pro, pero preferiblemente no más de tres residuos Pro.
En una forma de realización, el número total de residuos de aminoácidos en X1 será de 1 - 4, 1-3, o 1-2 residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos en X1 pueden ser cualquier residuo de aminoácido codificable y puede ser igual o diferente con la única condición de que al menos uno es Pro.
En otra forma de realización la secuencia X1 - Y no contendrá dos residuos de aminoácidos básicos contiguos (Lys, Arg) y en otra forma de realización adicional X1 contendrá un residuo de aminoácido con un grupo COOH libre (Glu, Asp) o un residuo de aminoácido con un grupo amino libre (Gln, Asn, His).
Ejemplos de secuencias X1 - Y - son GlnProLys; ThrProLys; GluProLys; GlyProLys; MetProLys; SerProLys; AspProLys; AlaAspProLys (SEC ID NO:8); AsnAspProLys (SEC ID NO:9); GluAspProLys (SEC ID NO:10) y AlaAspProLys (SEC ID NO:11).
La presente invención está también relacionada con las secuencias de polinucleótidos que codifican para los precursores de insulina reivindicados.
En otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para hacer un precursor de insulina dicho método comprendiendo
En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un proceso para hacer insulina humana desB30 o insulina humana, dicho método comprendiendo
En una forma de realización de la presente invención la célula huésped es una célula huésped de levadura y en otra forma de realización la célula huésped de levadura es seleccionada del género Saccharomyces. En otra forma de realización la célula huésped de levadura es seleccionada de la especie Saccharomyces cerevisiae.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 representa el plásmido de expresión pAK855 de S. cerevisiae que expresa el precursor el líder TA57 -EEGEPK(SEC ID NO:1-)-B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21).
Fig. 2 representa la secuencia de nucleótidos del cassette de expresión del plásmido de expresión de levadura pAK855 y la secuencia de aminoácidos inferida (SEC ID nº: 2 y 3).
Descripción detallada
Abreviaturas y nomenclatura
Reivindicaciones:
1. Precursor de insulina que comprende la fórmula
donde
X1 es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es pro y
Y es Lys o Arg.
2. Precursor de insulina según la reivindicación 1, donde X1 es 1-4 residuos de aminoácidos.
3. Precursor de insulina según la reivindicación 1, donde X1 es 1-3 o 1-2 residuos de aminoácidos.
4. Precursor de insulina según la reivindicación 1, donde X1 es GluPro y Y es Lys.
5. Precursor de insulina según la reivindicación 1, donde X1 es AspPro y Y es Lys.
6. Precursor de insulina según la reivindicación 1, donde X1 es GlnPro y Y es Lys.
7. Precursor de insulina según una de reivindicaciones 1 - 6, donde un pro es inmediatamente N-terminal a Y.
8. Secuencia de polinucleótidos que codifica un precursor de insulina con la fórmula
donde
X1 es una secuencia peptídica de 1 - 5 residuos de aminoácidos de los cuales al menos uno es Pro y
Y es un Lys o Arg.
9. Proceso para hacer un precursor de insulina dicho método comprendiendo
10. Proceso para hacer insulina humana desB30 o insulina humana, dicho método comprendiendo
11. Proceso según la reivindicación 10, donde X1 es 1-4 residuos de aminoácidos.
12. Proceso según la reivindicación 10, donde X1 es 1-3 residuos de aminoácidos.
13. Proceso según la reivindicación 10, donde X1 es 1-2 residuos de aminoácidos.
14. Proceso según una de las reivindicaciones 10-13, donde un pro es inmediatamente N-terminal a Y.
15. Proceso según la reivindicación 10, donde X1 es GluPro y Yes Lys.
16. Proceso según la reivindicación 10 donde X1 es AspPro y Y es Lys.
17. Proceso según la reivindicación 10, donde X1 es GlnPro y Y es Lys.
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