Un método de construcción de una proteína con dedos de cinc que se fija a sitios diana adyacentes,

comprendiendo el método los pasos de

(i) seleccionar un primer y un segundo polipéptido de dominio de fijación de DNA de la proteína con dedos de cinc, en donde cada uno de los dominios comprende un polipéptido con dedos de cinc, y en donde el primer dominio se fija a un primer sitio diana y el segundo dominio se fija a un segundo sitio diana, sitios diana que son sitios diana adyacentes y no solapantes que están separados por 0 a 3 pares de bases;

(ii) seleccionar un enlazador flexible en el cual, si los sitios diana adyacentes están separados por cero nucleótidos, el enlazador flexible tiene una longitud de seis aminoácidos o en donde, si los sitios diana adyacentes están separados por un solo nucleótido, el enlazador flexible tiene una longitud de siete, ocho o nueve aminoácidos o en donde, si los sitios diana adyacentes están separados por dos nucleótidos, el enlazador flexible tiene una longitud de diez, once o doce aminoácidos, o en donde, si los sitios diana adyacentes están separados por 3 nucleótidos, el enlazador flexible tiene una longitud de 12 aminoácidos; y

(iii) fusionar los dominios primero y segundo con el enlazador flexible, produciendo de este modo una proteína quimérica con dedos de cinc que se fija a sitios diana adyacentes

Poliproteínas con dedos de cinc que tienen enlazadores mejorados.

Antecedentes de la invención

Los dedos de cinc pertenecientes a la familia Cys₂-His₂ constituyen uno de los motivos de fijación de DNA más comunes encontrados en los eucariotas, y estos dedos de cinc han proporcionado un marco muy atractivo para el diseño y la selección de proteínas de fijación de DNA con nuevas especificidades de secuencia. Numerosos estudios han utilizado métodos de presentación de fago o ideas de diseño para explorar y alterar sistemáticamente la especificidad de las interacciones dedo de cinc-DNA (Desjarlais & Berg, Proteins Struct. Funct. Genet. 12:101-104 (1992); Desjarlais & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2256-2260 (1993); Rebar & Pabo, Science 263:671-673 (1994); Jamieson et al., Biochemistry 33:5689-5695 (1994); Choo & Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11163-11167 (1994); Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:344-348 (1995); y Greisman & Pabo, Science 275:657-661 (1997)).

El diseño por computadora basado en estructura ha sido utilizado para enlazar dedos de cinc Cys₂-His₂ con otros dominios de fijación de DNA, que incluyen otras proteínas con dedos de cinc, para generar proteínas híbridas que reconocen sitios extendidos (Pomerantz et al., Science 267: 93-96 (1995; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-3620 (1997)). Por ejemplo, proteínas con dedos de cinc se han enlazado a un dominio de dimerización GAL4 para desarrollar nuevos homo- y hetero-dímeros (Pomerantz et al., Biochemistry 4: 965-970 (1997)), y a un dominio de nucleasa para generar nuevas enzimas de restricción (Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160 (1996)). La fusión dedo de cinc/homeodominio está siendo testada respecto a aplicaciones potenciales en terapia génica (Rivera et al., Nature Med. 2: 1028-1032 (1996)).

Ha habido también varios intentos de aumentar la afinidad y especificidad de las proteínas con dedos de cinc por adición con dedos adicionales a una proteína de tres dedos (Rebar, (Tesis Ph.D.), Selection Studies of Zinc Finger-NA Recognition, Massachusetts Institute of Technology (1997); Shi, Y. (Tesis Ph.D.) Molecular Mechanisms of Zinc Finger Protein-Nucleic Acid Interactions, Johns Hopkins University (1995)) o por enlace en tándem de dos proteínas de tres dedos (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5525-5530 (1997)). Sin embargo, estas estrategias de diseño previas para proteínas con dedos múltiples, todas las cuales utilizaban enlazadores "TGEKP" canónicos (enlazadores que tienen la secuencia de aminoácidos treonina-glicina-glutamato-lisina-prolina) para conectar los dedos adicionales, daban como resultado aumentos de afinidad relativamente moderados. Existe por consiguiente necesidad de desarrollar enlazadores que proporcionen afinidad y especificidad incrementadas a proteínas con dedos de cinc quiméricas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona por tanto un método de utilización de diseño basado en la estructura para seleccionar enlazadores flexibles y producir proteínas con dedos de cinc con afinidad y especificidad mejoradas. La presente invención proporciona también un método para producir proteínas con dedos de cinc de acuerdo con las reivindicaciones con afinidad y especificidad mejoradas. Las proteínas con dedos de cinc producidas utilizando estos métodos tienen afinidades de fijación en el intervalo femtomolar y proporcionan, v.g., niveles altos (mayores que aproximadamente 70 veces) de represión de la transcripción en un solo sitio diana. Tales proteínas con dedos de cinc pueden utilizarse para regulación de la expresión génica, v.g., como agentes terapéuticos, diagnósticos, y para aplicaciones de investigación tales como genómica funcional.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de una proteína con dedos de cinc que se fija a sitios diana adyacentes de acuerdo con la reivindicación 1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína con dedos de cinc de acuerdo con la reivindicación 9.

En una realización, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas con dedos de cinc.

En una realización, los dominios primero y segundo son polipéptidos con dedos de cinc. En otra realización, el polipéptido con dedos de cinc se selecciona del grupo constituido por Zif268 y NRE. En otra realización, los polipéptidos con dedos de cinc son heterólogos.

En otra realización, la proteína con dedos de cinc comprende adicionalmente un polipéptido de dominio regulador.

En una realización, la proteína con dedos de cinc tiene afinidad femtomolar para los sitios diana adyacentes. En otra realización, la proteína con dedos de cinc tiene aproximadamente una afinidad 2-4 femtomolar para los sitios diana adyacentes.

En una realización, el enlazador flexible tiene una longitud de 8 u 11 aminoácidos. En otra realización, el enlazador flexible tiene la secuencia RQKDGERP o RQKDGGGSERP.

En una realización, los sitios diana están separados por uno o dos nucleótidos.

En una realización, los sitios diana adyacentes están separados por cero nucleótidos y el enlazador flexible tiene una longitud de 6 aminoácidos. En otra realización, los sitios diana adyacentes están separados por un solo nucleótido y el ensalzador flexible tiene una longitud de siete, ocho o nueve aminoácidos. En otra realización, los sitios diana adyacentes están separados por dos nucleótidos y el enlazador flexible tiene una longitud de diez, once o doce aminoácidos. En otra realización, los sitios diana adyacentes están separados por tres nucleótidos y el enlazador flexible tiene una longitud de 12 aminoácidos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el diseño basado en la estructura de un péptido con 6 dedos, 268//NRE. La estructura cocristalina del complejo ZiF268-DNA y el molde B-DNA (utilizado en la unión) se alinearon mediante fosfatos superpuestos (Pavletich & Pabo, Science 252:809817 (1991); Elrod-Erickson et al., Structure 4:1171-1180 (1996)). En este modelo, dos péptidos de 3 dedos se fijan a sitios correspondientes de 9 pares de bases (las bases se representan en color blanco) separados por una laguna de 2 pb (las bases se representan en color gris). Obsérvese que la orientación de un péptido de 3 dedos coincide casi exactamente con la del otro péptido de 3 dedos debido a que una vuelta helicoidal de este DNA subenrollado contiene 11 pares de bases.

La Figura 2 muestra representaciones esquemáticas de péptidos con dedos de cinc y de constructos informadores utilizados en los estudios de transfección descritos en esta memoria. La Figura 2A muestra péptidos con dedos de cinc. Cada dedo está representado con un círculo. Se muestra la secuencia de aminoácidos de un enlazador en el péptido Zif268 (que tiene un enlazador canónico "TGEKP", y los enlazadores más largos utilizados para conectar los péptidos de 3 dedos se indican al pie. En cada caso, el recuadro de la izquierda denota la región helicoidal e incluye el segundo de los residuos His conservados del dedo; la línea en zigzag denota la primera hoja ß del dedo siguiente, que incluye el primero de los residuos Cys conservados. La Figura 2B ilustra promotores de genes informadores de luciferasa. Las posiciones de los nucleótidos de la secuencia TATA, el codón inicial, y los sitios de fijación de los dedos de cinc se enumeran con respecto al sitio de comienzo de la transcripción (+1).

La figura 3 representa un ensayo de desplazamiento de gel. Se incubaron diversas cantidades (0, 0,01, 0,1, y 1 nM) del péptido NRE durante 1 hora con sitios de fijación libres (pistas 1-4) o sitios de fijación preincubados con 0,1 nM del péptido Zif268 durante 0,5 horas (pistas 5-8). Se indican las posiciones del DNA libre y de los complejos proteína-DNA.

La Figura 4 muestra estudios de fijación de competición. La Figura 4A, el péptido 268/NRE (5 pM) se preincubó con diversas cantidades (0,05, 0,5, 5 y 50 nM) de DNAs competidores fríos (pistas 3-14) durante 1 hora, y se añadió luego un ligero exceso molar (sobre la concentración de péptido) del sitio N/Z marcado (608 pM) a la mezcla de reacción. Se analizaron partes alícuotas por electroforesis en gel en diversos momentos, y este gel muestra los resultados al cabo de 600 horas de tiempo de incubación a la temperatura...

1. Un método de construcción de una proteína con dedos de cinc que se fija a sitios diana adyacentes, comprendiendo el método los pasos de

2. El método de la reivindicación 1, en donde el enlazador flexible tiene la secuencia de aminoácidos RQKDGERP.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el enlazador flexible tiene la secuencia de aminoácidos RQKDGGGSERP.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido con dedos de cinc se selecciona del grupo constituido por Zif268 y NRE.

5. El método de la reivindicación 1, en donde los polipéptidos con dedos de cinc son heterólogos.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína con dedos de cinc tiene afinidad femtomolar para los sitios diana adyacentes.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la proteína con dedos de cinc tiene aproximadamente una afinidad 2-4 femtomolar para los sitios diana adyacentes.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína con dedos de cinc comprende adicionalmente un polipéptido de dominio regulador.

9. Una proteína con dedos de cinc que se fija a sitios diana adyacentes, comprendiendo la proteína con dedos de cinc:

10. La proteína con dedos de cinc de la reivindicación 9, en donde el enlazador flexible tiene la secuencia de aminoácidos RQKDGERP.

11. La proteína con dedos de cinc de la reivindicación 9, en donde el enlazador flexible tiene la secuencia de aminoácidos RQKDGGGSERP.

12. La proteína con dedos de cinc de la reivindicación 9, en donde el polipéptido con dedos de cinc se selecciona del grupo constituido por Zif268 y NRE.

13. La proteína con dedos de cinc de la reivindicación 9, en donde los polipéptidos con dedos de cinc son heterólogos.

14. La proteína con dedos de cinc de la reivindicación 9, en donde la proteína con dedos de cinc tiene afinidad femtomolar para los sitios diana adyacentes.

15. La proteína con dedos de cinc de la reivindicación 14, en donde la proteína con dedos de cinc tiene aproximadamente una afinidad 2,4-femtomolar para los sitios diana adyacentes.

16. La proteína con dedos de cinc de la reivindicación 9, en donde la proteína con dedos de cinc comprende adicionalmente un polipéptido de dominio regulador.

17. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína con dedos de cinc de la reivindicación 9.