Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos de codificación de polipéptidos,

cuyos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y cuya secuencia de ácidos nucleicos (a) hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); y/o (b) tiene un grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 de al menos un 48%, como se determina por el programa align usando la matriz de identidad por defecto, una penalización de -16 para el primer residuo de un espacio y penalizaciones de -4 para posteriores residuos de un espacio; con la condición de que la secuencia de ácidos nucleicos no sea de la SEC ID NO:3, no sean los nucleótidos 601-978 de la SEC ID NO:3, y no sean los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO:1 estando los polinucleótido operativamente vinculados a una o más secuencias de control que dirijan la producción del polipéptido en una célula huésped de Bacillus, el ADN de cuya célula huésped, al recogerse y usarse como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb

Polipéptidos y ácidos nucleicos que los codifican.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso no terapéutico de determinados polipéptidos aislados en pienso, por ejemplo para mejorar el Coeficiente de Conversión de Alimentos (FCR) y/o para modular la microflora intestinal. Un ejemplo de un polipéptido de la invención es la así llamada proteína L12 de Bacillus licheniformis ATCC 14580, la cual tiene aquí la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos +1 a +85 de la SEC ID NO:2 (en cuanto a que sigue a los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2). La invención también se refiere al uso probiótico no terapéutico en pienso de cepas de Bacillus las cuales producen proteínas relacionadas con L12.

Antecedentes de la invención

WO 960739 expone el uso de una combinación de (i) una xilanasa, (ii) una proteasa, y opcionalmente una β-glucanasa en aditivos alimenticios. En el aditivo la proporción de actividad xilanasa por g de aditivo alimenticio con respecto a la actividad β-glucanasa por g de aditivo alimenticio es de 1:0-0,25. En WO 960739 se afirma que la inclusión de este aditivo alimenticio enzimático mejora la digestión del animal.

WO 03/093453 expone, en el Ejemplo 1, el diseño de una célula huésped de Bacillus licheniformis mejorada la cual no produce una pequeña proteína extracelular codificada por los nucleótidos 601 a 978 de la SEC ID NO:133 de WO 03/093453, teniendo la proteína la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:134 de WO 03/093453. Las SEC ID Nos. 133 y 134 de WO 03/093453 están incluidas en el presente listado de secuencias como las SEC ID Nos. 3 y 4, respectivamente. La secuencia de aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4 aquí es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO:2 aquí. WO 03/093453 no revela un polipéptido aislado teniendo los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2. WO 03/093453 tampoco revela una secuencia de ácidos nucleicos aislada teniendo los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1.

La accesión GenPept nº. YP_081375 es una proteína hipotética BL00275 de Bacillus licheniformis ATCC 14580. La accesión GenPept nº. YP_081375 es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO:2 aquí. La secuencia de la proteína hipotética BL00275 de Bacillus licheniformis ATCC 14580 también se ha introducido en UniProtKB/TrEMBL con el número de accesión primario Q65CU4. Esta secuencia también es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO:2 aquí.

La secuencia de nucleótidos codificando YP_081375 tiene la accesión GenBank nº. NC_006270. La accesión GenBank no. NC_006270 es idéntica a los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO:1 aquí.

Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que los polipéptidos relacionados con parte de esta secuencia hipotética de Bacillus licheniformis, es decir, los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, tienen un gran potencial para su uso en pienso.

La accesión SWISSPROT no. Q8DQM5 es una proteína spr0600 hipotética de 115 aminoácidos de Streptococcus pneumoniae (cepa ATCC BAA-255/R6). La secuencia también se describe en "Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6" por Hoskins et al, J. Bacteriol. 183:5709 (2001). Q8DQM5 no comprende una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2.

Martinez et al, Microbiology (1999), vol. 145, págs. 3155-3161 revela, en la Fig. 3, la secuencia de 91 aminoácidos deducida de la prebacteriocina lactococcin 972 con una parte madura predicha C-terminal de 66 aminoácidos. El porcentaje de identidad de cada uno de los prepolipéptidos y los polipéptidos maduros con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 es inferior al 33%.

Una búsqueda de bases de datos de nucleótidos con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 (la cual codifica los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2) reveló un fragmento de ADN con un 47% de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1. Este fragmento es parte de una secuencia resultante de un proyecto de secuenciación aún en curso. El organismo del cual deriva el fragmento se llama cepa 10 de Bacillus (Geobacillus) stearothermophilus. El trabajo de secuenciación se hace en la Universidad de Oklahoma (http://www.genome.ou.edu/.bstearo.html). No hay ninguna publicación de alguna de las secuencias de aminoácidos correspondiendo potencialmente a este fragmento de ADN, y por lo tanto tampoco ninguna indicación de alguna utilidad potencial de cualquier secuencia de aminoácidos codificada.

Un producto probiótico mezclado con la comida designado como BioPlus^TM2B está a la venta a través de Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Allé, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca. El producto contiene una cepa de Bacillus licheniformis la cual no obstante no produce una proteína relacionada con L12 (véase el Ejemplo 6 aquí).

Es un objetivo de la presente invención el proporcionar cepas especiales de Bacillus, así como métodos no terapéuticos para el uso de los polipéptidos y de las cepas de Bacillus en pienso.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso no terapéutico de polipéptidos aislados seleccionados del grupo que consiste en: (a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4 (b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%; como se ha determinado por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y (c) un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); (c) dentro de pienso.

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos en pienso.

La presente invención además se refiere al uso en pienso de una cepa de Bacillus la cual es positiva en la prueba del Ejemplo 6 aquí, es decir, el ADN del cual, cuando se recoge y se usa como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID Nos: 6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

Descripción detallada de la invención

El Polipéptido, sus Características, y Uso

La invención se refiere al uso no terapéutico en pienso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos con un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c) un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii) así como el uso de cualquiera de estas en la preparación de una composición para su uso en pienso. Estos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y/o modulando la microflora intestinal.

Un polipéptido a usar en la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano o fúngico. En una segunda forma de realización particular, el polipéptido es un polipéptido bacteriano Gram positivo tal como un polipéptido de Bacillus o una variante del mismo, por ejemplo un polipéptido de Bacillus licheniformis por ejemplo derivado de Bacillus licheniformis ATCC 14580, que es la cepa tipo de Bacillus licheniformis y está disponible bajo pedido a través de la American Type Culture Collection, ATCC. Cepas preferidas de Bacillus licheniformis son positivas en la prueba del...

1. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos de codificación de polipéptidos, cuyos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y cuya secuencia de ácidos nucleicos

(a) hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); y/o

(b) tiene un grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 de al menos un 48%, como se determina por el programa align usando la matriz de identidad por defecto, una penalización de -16 para el primer residuo de un espacio y penalizaciones de -4 para posteriores residuos de un espacio;

con la condición de que la secuencia de ácidos nucleicos no sea de la SEC ID NO:3, no sean los nucleótidos 601-978 de la SEC ID NO:3, y no sean los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO:1 estando los polinucleótido operativamente vinculados a una o más secuencias de control que dirijan la producción del polipéptido en una célula huésped de Bacillus, el ADN de cuya célula huésped, al recogerse y usarse como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

2. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 1.

3. Célula huésped de Bacillus recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 1 o el vector según la reivindicación 2, el ADN de cuya célula huésped, al recogerse y usarse como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

4. Método para la producción de un polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de codificación de polipéptidos del constructo según la reivindicación 1, cuyos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), comprendiendo el método (a) cultivar una célula huésped recombinante según la reivindicación 3 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

5. Método para la producción de un polipéptido según la reivindicación 4, comprendiendo el método (a) cultivar una cepa de Bacillus, el ADN de la cual, cuando se recoge y se usa como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb, cuyo fragmento de PCR codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y (b) recuperar el polipéptido.

6. Uso en pienso para objetivos no terapéuticos de un polipéptido, lo cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c) un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

7. Uso en la preparación de una composición para su uso en pienso de un polipéptido, la cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c) un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

8. Método no terapéutico para mejorar el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), donde un polipéptido, el cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), se añade al pienso, estando seleccionado el polipéptido del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c) un polipéptido que está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de a SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

9. Un aditivo para pienso comprendiendo un polipéptido, el cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en vitaminas liposolubles, vitaminas hidrosolubles, oligoelementos, y macrominerales, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c) un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

10. Una composición de pienso con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprendiendo un polipéptido, el cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c) un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).