POLIPEPTIDOS DE HAEMOPHILUS INFLUENZA.

Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 90% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:

2, 4, 6, 8 y 10, sobre la longitud completa de dicha secuencia, y un vehículo farmacéuticamente aceptable

Polipéptidos de Haemophilus influenza.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos (denominados en el presente documento "polinucleótido(s) BASB203"), a polipéptidos codificados por ellos (denominados en el presente documento "BASB203" o "polipéptido(s) BASB203"), a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. La invención se refiere a procedimientos para el uso de esos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas.

Antecedentes de la invención

El Haemophilus influenzae es una bacteria gram-negativa no móvil. El hombre es su único hospedador natural.

Los H. influenzae aislados normalmente se clasifican según su cápsula polisacarídica. Se han identificado seis tipos capsulares diferentes designados de la a) a la f). Los aislados que no consiguen aglutinarse con antisuero crecido contra uno de estos seis serotipos se clasifican como no tipificables, y no expresan cápsula.

El H. influenzae tipo b es claramente diferente de los otros tipos ya que es la causa principal de la meningitis bacteriana y de enfermedades sistémicas. El H. influenzae no tipificable (NTHi) sólo se aísla ocasionalmente de la sangre de pacientes con una enfermedad sistémica.

El NTHi es una causa habitual de neumonía, exacerbación de bronquitis crónica, sinusitis y otitis media.

La otitis media es una enfermedad infantil importante tanto por el número de casos como por sus potenciales secuelas. Cada año se registran en Estados Unidos más de 3,5 millones de casos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado, al menos, un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de tres años (1). Si se deja sin tratar, o si se vuelve crónica, esta enfermedad puede dar lugar a pérdida de audición que puede ser temporal (en el caso de acumulación de fluidos en el oído medio) o permanente (si el nervio auditivo está dañado). En párvulos, esa pérdida de audición puede ser responsable del retraso en el aprendizaje del habla.

Tres especies bacterianas se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, NTHi y M. catarrhalis. Éstas están presentes en un 60 a 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes demuestran que la S. pneumoniae, y la NTHi representa cada una un 30% aproximadamente, y la M. catarrhalis un 15% aproximadamente de los casos de otitis media (2). Se pueden aislar otras bacterias del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes,...) pero a una frecuencia mucho menor (2% de los casos o inferior).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; no obstante también son necesarios otros factores para dar lugar a las enfermedades (3-9). Estos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias hacia el oído medio a través de las trompas de Eustaquio, seguido por la iniciación de un proceso inflamatorio. Estos otros factores, a día de hoy, se desconocen. Se ha propuesto que, por ejemplo, una anomalía transitoria del sistema inmunitario después de una infección vírica podría provocar la incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (5). Una explicación alternativa es que la exposición a factores medioambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente se vuelven susceptibles al desarrollo de otitis media debido a la presencia mantenida de patógenos en el oído medio (2).

Se ha demostrado que diversas proteínas de H. influenzae están involucradas en la patogénesis o se ha demostrado que confieren protección después de la vacunación en modelos animales.

Se ha informado de la adherencia del NTHi a células epiteliales de la nasofaringe humana (10). Además de las fimbrias y los pili (11-15), se han identificado muchas adhesinas en NTHi. Entre ellas, dos proteínas de alto peso molecular expuestas en la superficie denominadas HMW1 y HMW2 han demostrado mediar en la adhesión de NTHi a células epiteliales (16). Otra familia de proteínas de alto peso molecular ha sido identificada en cepas de NTHi que carecen de proteínas que pertenezcan a la familia HMW1/HMW2. La proteína Hia de 115 kDa de NTHi (17) es muy similar a la adhesina Hsf expresada por cepas de H. influenzae de tipo b (18). Otra proteína, la proteína Hap muestra similitudes con las serinproteasas IgA1 y ha demostrado estar involucrada tanto en la adhesión como en la entrada a la célula (19).

Se han identificado y se han numerado cinco proteínas de la membrana exterior principales (OMP).

Los estudios originales usando cepas de H. influenzae tipo b demostraron que anticuerpos específicos para P1 y P2 protegían a ratas no adultas frente a exposiciones posteriores (20-21). Se encontró que la P2 es capaz de inducir anticuerpos bacterianos y opsónicos, que están dirigidos contra las regiones variables presentes en las estructuras en bucle expuestas sobre la superficie de esta OMP integral (22-23). La lipoproteína P4 también podía inducir anticuerpos bactericidas (24).

La P6 es una lipoproteína asociada al péptidoglicano conservada que constituye el 1-5% de la membrana externa (25). Posteriormente se identificó una lipoproteína aproximadamente del mismo peso molecular, denominada PCP (proteína de reacción cruzada con P6) (26). Una mezcla de las lipoproteínas conservadas P4, P6 y PCP no reveló ninguna protección tal y como se mide en un modelo de otitis media en chinchilla (27). La P6 sola parece inducir protección en el modelo de chinchilla (28).

La P5 tiene una homología de secuencia con la OmpA integral de Escherichia coli (29-30). La P5 parece experimentar una deriva antigénica durante infecciones persistentes con NTHi (31). No obstante, regiones conservadas de esta proteína indujeron protección en el modelo de chinchilla de otitis media.

En línea con las observaciones realizadas con gonococos y meningococos, el NTHi expresa un receptor de transferrina humana dual compuesto de TbpA y TbpB cuando se crece con limitación de hierro. Ratas no adultas protegidas anti-TbpB. (32). También se han descrito para el NTHi receptores de hemoglobina/haptoglobina (33). También se ha identificado un receptor para Haem:Hemopexina (34). En el NTHi también está presente un receptor de lactoferrina, pero aún no se ha caracterizado (35).

Una OMP de 80 kDa, el antígeno de superficie D 15, proporciona protección frente a NTHi en un modelo de exposición en ratón. (36). Una lipoproteína de la membrana exterior de 42 kDa, la LPD, está conservada entre los Haemophilus influenzae e induce anticuerpos bactericidas (37). Se encontró que una OMP menor de 98 kDa (38), es un antígeno protector, esta OMP puede ser perfectamente una de las OMP inducibles por la limitación de Fe o de las adhesinas de elevado peso molecular que se han caracterizado. El H. influenzae produce la actividad proteasa IgA1 (39). Las proteasas IgA1 de NTHi presentan un alto grado de variabilidad antigénica (40). Otra OMP de NTHi, la OMP 26, una proteína de 26 kDa ha demostrado aumentar el aclaramiento pulmonar en un modelo de rata (41). La proteína HtrA de NTHi también ha demostrado ser un antígeno protector. De hecho, esta proteína ha protegido a la chinchilla frente a otitis media y ha protegido a ratas no adultas frente a bacteremia de H. influenzae de tipo b (42).

Referencias de los antecedentes

1. Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19:823

2. Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267

3. Dickinson, DP y col. (1988) J. Infect. Dis. 158:205

4. Faden, HL y col. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612

5. Faden, HL y col (1994) J. Infect. Dis. 169:1312

6. Leach, AJ y col. (1994) Pediatr. Infect. Dis. J. 13:983

7. Prellner, KP y col. (1984) Acta Otolaryngol. 98:343

8. Stenfors, L-E and Raisanen, S. (1992) J. Infect. Dis. 165:1148

9. Stenfors, L-E and Raisanen, S. (1994) Acta Otolaryngol. 113:191

10. Read, RC. y col. (1991) J. Infect. Dis. 163:549

11. Brinton, CC. y...

1. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 90% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, sobre la longitud completa de dicha secuencia, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La composición según la reivindicación 1 en la que el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 95% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, sobre la longitud completa de dicha secuencia.

3. La composición según la reivindicación 1 ó 2 en la que el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10.

4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el polipéptido aislado consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10.

5. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido aislado que comprende un fragmento inmunógeno de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, en la que el fragmento inmunógeno (si fuera necesario, cuando está acoplado a un vehículo) es capaz de generar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10 respectivamente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Una composición de vacuna que comprende un fragmento inmunógeno de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, en la que el fragmento inmunógeno (si fuera necesario, cuando está acoplado a un vehículo) es capaz de generar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10 respectivamente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición de vacuna que comprende una proteína de fusión que comprende el polipéptido o fragmento inmunógeno definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 90% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, sobre la longitud completa de dicha secuencia y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición según la reivindicación 9 en la que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10.

11. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 y 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10 que se puede obtener seleccionando una librería apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de ADN correspondiente de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9 respectivamente o uno de sus fragmentos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición de vacuna que comprende una vesícula de la membrana externa de la bacteria que comprende el polipéptido, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se puede obtener a partir de una célula hospedadora que comprende un vector de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido aislado definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 y una región aguas arriba modificada de dicho polinucleótido cuya región aguas arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo fuerte, en el que el polipéptido, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión se expresan sobre la membrana externa, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición de vacuna que comprende una vesícula de la membrana externa de la bacteria que comprende el polipéptido, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se puede obtener a partir de una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que comprende el polinucleótido aislado definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 y una región aguas arriba modificada de dicho polinucleótido aislado cuya región aguas arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo fuerte, en el que el polipéptido, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión se expresan sobre la membrana externa, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición de vacuna que comprende un vector de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido aislado definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 y una región aguas arriba modificada de dicho polinucleótido cuya región aguas arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo fuerte, una célula hospedadora que comprende dicho vector, o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que expresa el polipéptido aislado, el fragmento inmunógeno, o la proteína de fusión según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la que dicha composición de vacuna comprende adicionalmente uno o más de los siguientes grupos de antígenos:

        a)        uno o más polisacáridos capsulares de pneumococo;

        b)        uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedador frente a una infección por M. catarrhalis;

        c)        uno o más antígenos de proteínas que pueden proteger a un hospedador frente a una infección por Streptococcus pneumoniae;

        d)        uno o más antígenos de proteínas adicionales de Haemophilus influenzae no tipificables;

        e)        uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedador frente a RSV;

        f)        uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedador frente al virus de la gripe.

17. La composición de vacuna de la reivindicación 16, en la que el uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedador frente a una infección por M. catarrhalis se seleccionan de una lista que consta de OMP106, OMP21, UspA1 y/o UspA2, OmpCD, D15 y Hly3.

18. La composición de vacuna de la reivindicación 16 ó 17, en la que el uno o más antígenos de proteínas que pueden proteger a un hospedador frente a una infección por Streptococcus pneumoniae se seleccionan de una lista que consta de: pneumolisina, PspC, PsaA y CbpA.

19. La composición de la las reivindicaciones 16 a 18, en la que el uno o más antígenos de proteínas adicionales de Haemophilus influenza no tipificable se seleccionan de una lista que consta de: OMP26, P6, proteína D, Hia, Hsf, Hmw1, Hmw2, How3, Hmw4, Hap, D15, P2 y P5.

20. Uso de una cantidad eficaz de un polipéptido aislado, un fragmento inmunógeno o una proteína de fusión según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la preparación de un medicamento para la generación de una respuesta inmunitaria en un animal que da lugar a la prevención o el tratamiento de una infección.

21. Uso de una cantidad eficaz de un polinucleótido aislado definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en la preparación de un medicamento para la generación de una respuesta inmunitaria en un animal que da lugar a la prevención o el tratamiento de una infección.

22. Uso de un vector de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido aislado definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 y una región aguas arriba modificada de dicho polinucleótido cuya región aguas arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo fuerte, una célula hospedadora que comprende dicho vector, o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que expresa un polipéptido aislado, un fragmento inmunógeno o una proteína de fusión según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la vesícula de la membrana externa de la bacteria definida en las reivindicaciones 13 ó 14, en la preparación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un animal que da lugar a la prevención o el tratamiento de una infección.

23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en la que la infección es una infección por H. influenzae no tipificable.

24. Una composición terapéutica útil en el tratamiento de seres humanos con una enfermedad por H. influenzae no tipificable que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra un polipéptido aislado o un fragmento inmunógeno según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéutico adecuado, y en el que dicho anticuerpo es inmunoespecífico para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10.

25. Un procedimiento para la fabricación de una composición de vacuna que comprende las etapas de preparación de células hospedadoras que comprenden un polinucleótido recombinante que comprende el polinucleótido aislado definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 que expresa un polipéptido recombinante que es el polipéptido aislado, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión según se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que comprende el polipéptido recombinante, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión y la formulación de dicho polipéptido recombinante, fragmento inmunógeno o proteína de fusión con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición que comprende una cantidad eficaz del polipéptido aislado, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión según se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la generación de una respuesta inmunitaria en un animal que da lugar a la prevención o el tratamiento de una infección.

27. Una composición que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido aislado definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 para generar una respuesta inmunitaria en un animal que da lugar a la prevención o el tratamiento de una infección.

28. Una composición que comprende un vector de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido aislado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 y una región aguas arriba modificada de dicho polinucleótido cuya región aguas arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo fuerte, una célula hospedadora que comprende dicho vector o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que expresa un polipéptido aislado, un fragmento inmunógeno o una proteína de fusión según se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la vesícula de la membrana externa de la bacteria definida en la reivindicación 13 ó 14, para generar una respuesta inmunitaria en un animal que da lugar a la prevención o el tratamiento de una infección.

29. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 en la que la infección es infección por H. influenzae no tipificable.