Una partícula de alfavirus quimérico que comprende

ARN que codifica una o más proteínas no estructurales derivadas de un primer alfavirus y una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus,

en la que dicha señal de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 con nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural;

una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus; y

una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus,

en la que dicho ARN comprende además una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un agente terapéutico o un inmunógeno

Partículas de replicones de alfavirus quiméricos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a partículas de alfavirus quiméricos. Los alfavirus quiméricos de la presente invención son útiles en la administración ex vivo e in vivo de genes heterólogos que tienen aplicaciones terapéuticas o profilácticas.

Antecedentes

Los alfavirus comprenden un conjunto de virus transmitidos por artrópodos, relacionados genética, estructural y serológicamente de la familia Togaviridae. Dentro del género Alphavirus se han clasificado veintiséis virus y subtipos de virus conocidos, que incluyen el Virus Sindbis, el Virus de Semliki Forest, el Virus de Ross River y el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana.

El Virus Sindbis es el miembro prototípico del género Alphavirus de la familia Togaviridae. Su estrategia de replicación ha sido bien caracterizada en una variedad de células cultivadas y sirve como modelo de otros alfavirus. En síntesis, el genoma del Virus Sindbis (como el de otros alfavirus) es una molécula de ARN de sentido positivo monocatenario de aproximadamente 12 kb con casquete y poliadenilada, y contenida en una cubierta proteica, la cápside, codificada por el virus. La nucleocápside se rodea además de una envoltura lipídica, derivada del huésped, dentro de la que hay insertadas dos glucoproteínas específicas virales, la E1 y E2, que están ancladas por una cola citoplasmática con la nucleocápside. Ciertos alfavirus (p. ej., SFV) mantienen también una proteína adicional, la E3, que es un producto de la escisión de la proteína precursora de E2, la PE2.

Tras la adsorción de las partículas virales hacia las células diana, la penetración y el descubrimiento de la nucleocápside para liberar el ARN genómico viral en el citoplasma, se genera el proceso replicativo a través de cuatro proteínas no estructurales (nsP) alfavirales, traducidas de los dos tercios 5' del genoma viral. A su vez, la síntesis de un ARN de cadena negativa de longitud completa proporciona un molde para la síntesis de más ARN genómico de cadena positiva y un ARN subgenómico 26S expresado de manera abundante, iniciada internamente en el promotor de la región de unión. Las proteínas estructurales alfavirales se traducen del ARN 26S subgenómico, que representa el tercio 3' del genoma, y como las nsP, se procesan después de la traducción en las proteínas individuales.

Se están desarrollando varios miembros del género Alphavirus como vectores de expresión "replicones" para su uso como vacunas y compuestos terapéuticos. Los vectores replicones se pueden utilizar en varios formatos, incluyendo ADN, ARN y partículas de replicones recombinantes. Tales vectores replicones han sido obtenidos de alfavirus que incluyen, por ejemplo, el Virus Sindbis (Xiong et al. (1989), Science 243:1188-1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998), J. Virol. 72:950-958; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603), el Virus de Semliki Forest (Liljestrom (1991), Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565) y el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401). Actualmente, hay una extensa biobliografía que demuestra la eficacia de los vectores replicones de alfavirus para aplicaciones tales como vacunas (véase, por ejemplo, Dubensky et al., ibid; Berglund et al., ibid; Hariharan et al., ibid, Pushko et al., ibid; Polo et al., ibid; Davis et al., (2000) J. Virol. 74:371-378; Schlesinger y Dubensky (1999) Curr. Open. Biotechnol. 10:434-439; Berglund et al. (1999) Vaccine 17:497-507). En términos generales, partícula de "replicón" se refiere a una partícula viral que contiene un ácido nucleico auto-replicante. La propia partícula de replicón se considera generalmente incompetente o defectuosa para la replicación. Es decir, que no se producirá una progenie de partículas de replicones cuando una célula es infectada con una partícula de replicón. A través de los años, han surgido varios términos que se usan como sinónimos para describir las partículas de replicones. Estos términos incluyen partícula viral recombinante, partícula de alfavirus recombinante, partícula de replicón de alfavirus y partícula de replicón. Sin embargo, como se usan en la presente memoria, todos estos términos se refieren a una unidad de tipo virión que contiene un vector replicón de ARN derivado de un virus, específicamente, un vector replicón de ARN alfaviral. Además, se puede hacer re-ferencia colectivamente a estos términos como vectores, constructos de vectores o vectores de administración de genes.

Actualmente, se están desarrollando varios alfavirus como sistemas de administración de genes para vacunas y otras aplicaciones terapéuticas. Aunque son generalmente bastante similares en cuanto a sus características globales (p. ej., la estructura, la replicación), cada alfavirus puede presentar alguna propiedad particular (p. ej., unión a receptores, sensibilidad al interferón y perfil patológico) que sea única. Para aprovechar las propiedades más deseables de cada virus, se ha desarrollado un enfoque de partículas de replicones quiméricos. Específicamente, una partícula de replicón de alfavirus quimérico puede tener ARN derivado de un virus y uno o más componentes estructurales derivados de un virus diferente. Los componentes virales derivan generalmente de virus estrechamente relacionados; sin embargo, es posible la existencia de partículas de virus quiméricos procedentes de familias de virus divergentes.

Se había demostrado con anterioridad que es posible generar partículas de replicones de alfavirus quiméricos en las que el vector de ARN derive de un primer alfavirus y que las proteínas estructurales de la "cubierta" (p. ej., glucoproteínas de la envoltura) deriven de un segundo alfavirus (véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con número de serie 09/236.140; véanse también, las patentes 5.789.245; 5.842.723; 5.789.245; 5.842.723 y 6.015.694; así como los documentos WO 95/07994, WO 97/38087 y WO 99/18226). Sin embargo, aunque las estrategias descritas anteriormente fueron satisfactorias para elaborar varias quimeras alfavirales, tales partículas quiméricas no se producen siempre con rendimientos comercialmente viables, quizás debido a las interacciones menos eficientes entre el ARN viral y las proteínas estructurales, que dan como resultado una menor productividad.

De este modo, siguen siendo necesarias composiciones que comprendan y procedimientos para elaborar y usar partículas de replicones quiméricos y replicones, por ejemplo, para su uso como vehículos de administración de genes que tengan un tropismo celular y tisular alterado y/o una antigenicidad superficial frente a las proteínas estructurales.

Resumen

La presente invención incluye composiciones que comprenden alfavirus quiméricos y partículas de replicones de alfavirus quiméricos, así como procedimientos para crear estas partículas.

La presente invención proporciona una partícula de alfavirus quimérico que comprende:

ARN que codifica una o más proteínas no estructurales derivadas de un primer alfavirus y una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus, en la que dicha partícula de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 con nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural;

una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus; y

una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus,

en la que dicho ARN comprende además una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una agente terapéutico o un inmunógeno.

La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una partícula de alfavirus de la invención en combinación con un vehículo, diluyente o receptor farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona también una partícula de alfavirus según la invención que expresa uno o más antígenos derivados de al menos un agente patógeno, para su uso en la estimulación de una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.

La invención también proporciona un procedimiento para producir partículas de replicones...

1. Una partícula de alfavirus quimérico que comprende

ARN que codifica una o más proteínas no estructurales derivadas de un primer alfavirus y una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus, en la que dicha señal de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 con nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural;

una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus; y

una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus,

en la que dicho ARN comprende además una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un agente terapéutico o un inmunógeno.

2. La partícula de alfavirus quimérico de la reivindicación 1, en la que la señal de empaquetamiento está insertada en una eliminación carboxi-terminal de un gen de proteína no estructural.

3. La partícula de alfavirus quimérico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que dicha proteína de la envoltura deriva del segundo alfavirus.

4. Una partícula de alfavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha partícula es una partícula de replicón y en la que además dicho ARN comprende, en el sentido de 5' a 3' (i) una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales de alfavirus; (iii) un medio para expresar un ácido nucleico heterólogo; (iv) la secuencia de ácido nucleico heteróloga; (v) una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales y (vi) un tracto poliadenilado, en el que dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga sustituye un gen de proteína estructural de alfavirus.

5. La partícula de alfavirus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho primer alfavirus es el Virus Sindbis (SIN) y en la que dicho segundo alfavirus es el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE).

6. La partícula de alfavirus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho primer alfavirus es el VEE y en la que dicho segundo alfavirus es el SIN.

7. La partícula de alfavirus según la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico heterólogo sustituye al menos una proteína estructural de alfavirus.

8. Una composición farmacéutica que comprende la partícula de alfavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en combinación con un vehículo, diluyente o receptor farmacéuticamente aceptable.

9. Una partícula de alfavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que expresa uno o más antígenos derivados de al menos un agente patógeno, para su uso en la estimulación de una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.

10. Un procedimiento para generar partículas de replicones de alfavirus que comprende introducir en una célula huésped: