NUEVO METODO DE DETECCION Y CUANTIFICACION DE LEVADURAS DE LOS GENEROS BRETTANOMYCES Y/O DEKKERA EN VINOS TINTOS Y OTRAS BEBIDAS FERMENTADAS O CARBONIZADAS.

Nuevo método de detección y cuantificación de levaduras de los géneros Brettanomyces y/o Dekkera en vinos tintos y otras bebidas fermentadas o carbonatadas.

Consiste en el empleo de medios selectivo-diferenciales para favorecer el crecimiento de levaduras de los géneros Brettanomyces/Dekkera, asociado al seguimiento de la degradación de ácido p-cumárico y consiguiente formación de 4-etilfenol (defecto olfativo) mediante análisis instrumental HPLC/PDA/ESI-MS, lo que permite estimar y/o cuantificar la población microbiana existente y su actividad enzimática vinilfenolreductasa potencial mediante un modelo de regresión estadístico. Esta técnica es aplicable a cualquier fase de una industria enológica y otros tipos de industrias de bebidas

Nuevo método de detección y cuantificación de levaduras de los géneros Brettanomyces y/o Dekkera en vinos tintos y otras bebidas fermentadas o carbonatadas

Sector técnico

Enología: Vinificación en Tinto.

Estado de la técnica anterior

Las levaduras de los géneros Brettanomyces/Dekkera deterioran la calidad de los vinos tintos fundamentalmente durante el envejecimiento en barrica. Poseer técnicas analíticas de fácil aplicación, que indiquen la presencia de estos microorganismos de una forma sensible, permite a la bodega la detección y aislamiento de las barricas afectadas y la aplicación de medidas correctoras y de profilaxis que ayuden a evitar y/o minimizar el problema.

Brettanomyces y Dekkera tienen una morfología característica con células ojivales y de pequeño tamaño. Sin embargo, ni las características morfológicas, ni los métodos clásicos de identificación son adecuados para trabajos rutinarios de microbiología enológica, además de no permitir la detección de poblaciones viables pero no cultivables, por lo que en los últimos años se han desarrollado diferentes técnicas tendentes a una rápida y segura identificación de estas especies de levaduras alterantes de otras especies distintas presentes en el vino (Suárez et al. Food Chem. 2007, 102, 10-21).

En la detección de colonias de Brettanomyces/Dekkera se ha utilizado con resultados aceptables, y como prueba rápida, la microscopia de fluorescencia de las células previamente marcadas con sondas fluorescentes (RNA FISH hybridization) que tienen como diana el fragmento 26S del ARN ribosómico (Stender et al. J. Microbiological Methods, 2002, 48, 1-17; Stender et al. Appl. Env. Microbiol., 2001, 67, 938-941). Este método presenta una gran sensibilidad específica para Dekkera bruxellensis.

Otra técnica utilizada para identificar levaduras alterantes tipo Brettanomyces/Dekkera en vinos consiste en cultivar las cepas aisladas, extraer los ácidos grasos de la pared celular y cuantificar el tipo y cantidad de cada uno de ellos por cromatografía de gases después de derivatizarlos como ésteres metílicos (Sancho, et al. Food Microbiol. 2000, 17, 613-624).

Sin embargo, las técnicas basadas en métodos de biología molecular como PCR (Polymerase Chain Reaction) se han impuesto en la actualidad como las más rápidas sensibles y específicas. Generalmente, estos métodos se han centrado en la amplificación de determinados fragmentos específicos de ADN y ARN ribosómico.

Se han utilizado técnicas como la determinación electroforética de cariotipos, y la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD-PCR) adaptándolas a cepas de Brettanomyces/Dekkera aisladas de vinos (Mitrakul et al. Food Microbiol., 1999, 16, 3-14). También, se han detectado secuencias específicas de regiones ITS (internal transcribed spacer regions) situadas entre genes de ARN ribosómico que son lo suficientemente divergentes (especialmente dos de ellas ITS 1 e ITS2) para utilizarlas como dianas de identificación de modo específico y fiable para 4 especies de Brettanomyces/Dekkera (Egli y Henick-Kling. Am. J. Enol. Vitic., 2001, 52, 241-247). Existen protocolos específicos para distinguir Brettanomyces bruxellensis y Brettanomyces anomalus utilizando los iniciadores DB90F y DB394R que utilizan como diana el loop D1-D2 del gen 26S rRNA que no dan lugar a la formación de productos de amplificación cuando se utilizan otras especies de Brettanomyces spp. ni con otras levaduras (Cocolin et al. Appl. Env. Microbiol., 2004, 70, 1347-1355).

También se han utilizado técnicas de amplificación anidada (nested-PCR) que utilizando cuatro iniciadores, dos externos y dos internos, permiten la detección de Brettanomyces spp. partiendo directamente de vino, sin necesidad de aislar ni cultivar las células y con gran reproducibilidad y especificidad (Navascués y Rasines. Enologos, 2003, 23, 24-26). Esta nueva técnica permite una gran versatilidad y una rápida detección del desarrollo de Brettanomyces desde fases iniciales. El problema principal de las técnicas moleculares radica en la sensibilidad y la dificultal para diferenciar material genético procedente de células no viables ó muertas y células vivas.

Finalmente, otra posible forma de actuación es la detección en vinos de un producto metabólico de la actividad de Brettanomyces/Dekkera, los etilfenoles. Sin embargo, este método presenta el problema de que a no ser que el seguimiento sea continuo y muy exhaustivo puede ser que estos compuestos se detecten cuando ya sea demasiado tarde para actuar. No obstante el análisis y cuantificación de etilfenoles en vinos utilizando acoplamientos de técnicas separativas como la cromatografia de gases, y analíticas como la espectrometría de masas (GC/MS) permite la identificación y cuantificación del 4-etilfenol y del 4-etilguaiacol con una elevada sensibilidad.

Muchas veces se asocia esta técnica analítica instrumental con el análisis sensorial en serie, convirtiéndose entonces en una potente herramienta para el control de calidad en vinos (GC/MS/olfactometry). Con este procedimiento, una vez que se ha producido la separación cromatográfica y quedan aislados al final de la columna capilar los distintos compuestos volátiles, se realiza una división de flujo y parte es desviada a un dispositivo que permite que un catador adiestrado indique la intensidad y calidad olfativa del compuesto volátil separado, y otra fracción del mismo es dirigida a la fuente de ionización de un espectrómetro de masas para identificar de forma precisa la molécula que ha producido dicha sensación.

La mayoría de los trabajos realizados para la detección de esta problemática se han abordado desde puntos de vista casi estrictamente microbiológicos (presencia de levaduras Dekkera/Brettanomyces) o químicos (detección de etilfenoles) y no desde perspectiva puramente enológica. Para ello empleamos la combinación de un medio selectivo-diferencial líquido de formulación propia y análisis instrumental mediante técnica HPLC con objeto de evaluar la "Actividad potencial hidroxicinamato descarboxilasa y vinilfenol reductasa de un vino".

Existen varios métodos modernos basados en técnicas de biología molecular que pueden aplicarse a la identificación de estas levaduras, dentro de las más importantes se deben considerar: análisis de secuencias parciales de ADN ribosómico 26S; Ampliación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD)-PCR; PCR utilizando sondas de secuencias específicas; hibridación con sondas de ADN específicas y detección por microscopía de fluorescencia. Generalmente estos métodos no permiten cuantificar poblaciones pequeñas de pocas células por litro que pasan desapercibidas y luego proliferan en la barrica produciendo etilfenoles. Tampoco pueden diferenciar entre células viables y muertas (Suárez-Lepe e Iñigo. Microbiología Enológica. Fundamentos de Vinificación. Mundi-Prensa. 2004, 422-424), pudiendo inducir a confusión en vinos ya estabilizados. La técnica propuesta permite detectar poblaciones pequeñas (hasta 1 ufc/ml) y detecta sólo células viables que son las que pueden originar problemas, por lo que mejora en estos aspectos a las técnicas moleculares.

Otra opción son las técnicas de análisis instrumental para la detección de etilfenoles como la cromatografia de gases asociada a espectrometria de masas (GC/MS). La detección de etilfenoles se ha realizado por cromatografia gaseosa de extractos obtenidos por extracción líquido-líquido con disolventes orgánicos (Chatonnet y Boidron. Sciences des aliments, 1988, 8, 479-488.), microextracción en fase sólida por espacio cabeza (HSPME) (Monje et al. (2002). Anal. Chimica Acta, 2002, 458, 111-117.; Martorell et al. J. Chromatography, 2002, 975, 349-354.) y extracción por absorción con twister (SBSE) (Díez et al. J. Chromatography A, 2004, 1025, 263-267.). Pero la problemática de estos análisis reside en el equipo requerido y en que la detección del problema se produce una vez que este ya se ha desarrollado, lo que compromete la aplicación de medidas correctoras en el vino dentro de un periodo de tiempo prudencial. La cromatografia líquida de alta presión (HPLC) no se utiliza debido a la falta de sensibilidad en el análisis de concentraciones pequeñas (10-100 ppb) de estos compuestos, lo cual dificulta su aplicación directa en vinos, pero ha sido aplicada con éxito en la detección de actividad enzimática hidroxicinamato...

1. Procedimiento de cuantificación de la población de levaduras de los géneros Brettanomyces/Dekkera de vinos y otras bebidas caracterizado porque comprende las siguientes etapas: