Polinucleótido aislado que codifica para una fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo constituido por:

(a) un polinucleótido aislado que codifica para la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2

(b) un polinucleótido aislado que se hibrida al polinucleótido según (a) en unas condiciones astringentes

(c) un polinucleótido aislado que presenta por lo menos 70% de identidad con el polinucleótido según (a)

presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4

Nuevas fitasas bacterianas y procedimiento de preparación de dichas fitasas.

La presente invención se refiere a nuevas fitasas de origen bacteriano, así como a sus procedimientos de preparación respectivos. La presente invención se refiere más particularmente a nuevas fitasas procedentes de bacterias del género Acidocella, así como a los polinucleótidos que codifican para estas fitasas. La invención se refiere asimismo a unos vectores que contienen estos polinucleótidos, y a unos organismos hospedantes transformados que expresan dichas fitasas en sus tejidos. La invención se refiere asimismo a nuevos extractos bacterianos que comprenden por lo menos una actividad fitasa.

En particular, los extractos bacterianos y las fitasas de la presente invención están particularmente adaptados a su utilización en unas composiciones alimenticias destinadas a la alimentación animal. Esta adaptación está relacionada con sus propiedades, en particular su actividad en unas condiciones de temperatura y de pH que corresponden a las condiciones de preparación de dichas composiciones así como las encontradas en el sistema digestivo de los animales.

El fósforo es un elemento esencial para la vida de todos los organismos. En particular, es primordial para los criadores de animales de granja asegurarse que sus animales ingieren una cantidad suficiente para optimizar su crecimiento y su desarrollo. La mayoría de los animales de granja son alimentados con unas composiciones alimenticias a base de vegetales. Estos vegetales contienen grandes cantidades de fosfato que almacenan en sus tejidos en forma de un compuesto de reserva, el ácido fítico. Como media, el ácido fítico contiene de 50 a 70% del fósforo presente en las plantas. El ácido fítico está naturalmente movilizado y el fosfato que contiene se libera en la mayoría de los animales de granja, en particular los rumiantes. Sin embargo, el ácido fítico no es metabolizado por los animales monogástricos tales como el cerdo y las aves de corral. En estos animales, el ácido fítico contenido en su ración alimenticia es por lo tanto evacuado con los excrementos, y el criador debe completar dicha ración con fosfato inorgánico con el fin de que sus animales ingieran una cantidad suficiente de fósforo. Esta estrategia genera un sobrecoste para el criador y una contaminación procedente de la emisión en el medioambiente del ácido fítico no asimilado. Esta contaminación es aún más importante en las zonas de cría intensa.

El ácido fítico es conocido asimismo por ser un quelante de elementos nutritivos importantes contenidos en la ración alimenticia, como, por ejemplo, el magnesio, el calcio, el zinc o el hierro. Esta propiedad conduce a una disminución de la calidad nutritiva de la ración alimenticia que da al ácido fítico la propiedad de agente anti-nutricional.

Con el fin de responder a los diferentes inconvenientes relacionados con la ausencia de asimilación del ácido fítico por los animales monogástricos, se ha previsto introducir una enzima, la fitasa, en la ración alimenticia de estos animales de cría. La fitasa hidroliza el ácido fítico liberando inositol y fosfato inorgánico. Unas fitasas y los genes que codifican estas fitasas han sido aislados a partir de numerosos organismos. Las fitasas han sido mayoritariamente aisladas a partir de hongos (Howson y Davis, 1983, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382; Wyss et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol., 65(2), 359-366). Entre los hongos que producen una fitasa, se pueden citar los hongos del género Aspergillus, en particular A. ficuum (Ullah y Gibson, 1987, Preparative Biochemistry 17(1), 63-91; Ullah y Dischinger, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun., 192(2), 747-753), A. terreus (Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252), A. niger (Dvorakova et al., 1997, Folia Microbiol (Praha), 42(4), 349-352), A. fumigatus (Pasamontes et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63(5), 1696-1700), del género Penicillium, en particular P. caseicolum, del género Myceliophtora, en particular M. thermophila (Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252), del género Talaromyces, en particular T. thermophilus, del género Neurospora, en particular N. crassa y N. sitophila, del género Thermomyces, en particular T. lanuginosus (Berka et al., 1998, Appl Environ Microbiol. 64(11), 4423-4427), o del género Monascus, en particular M. anka. Asimismo, se han encontrado unas fitasas en unas bacterias. A título de ejemplo, se pueden citar las bacterias de los géneros Bacillus, en particular B. subtilis (Powar y Jagannathan, 1982, J. Bacteriol. 151(3), 102-1108; Shimizu, 1992, Biosci. Biotech. Biocem. 56(8), 1266-1269; Keruvo et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085), Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Austral. J. Biol. Sci. 23, 1207-1220), Escherichia, en particular E. coli (Golovan et al., 2000, Can. J. Microbiol. 46, 59-71), Enterobacter (Yoon et al., 1996, Enzyme and microbiol. Technol; 18, 449-454), o Streptomyces. Se han aislado asimismo unas fitasas de levaduras (Dvorakova, 1998, Folia Microbiol. 43(4), 323-338), como las de las levaduras Schwaniiomyces occidentalis y Saccharomyces cerevisiae. Por último, se han encontrado unas fitasas en las plantas, en particular en la soja (Ullah y Gibson, 1988, Arch. Biochem. Biophys., 260(2), 514-20), en el maíz (Maugenest et al., 1997, Biochem J., 322 (Pt 2), 511-7); Maugenest et al., 1999, Plant Mol. Biol., 39(3), 503-14), o en Arabidopsis (Mullaney y Ullah, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., 251(1), 252-5).

Entre las propiedades que permiten caracterizar las fitasas, se encuentra la constante de Michaelis (Km) frente al ácido fítico, el pH óptimo y la temperatura óptima de actividad, así como la estabilidad de esta actividad a pH y temperaturas determinados. Unos datos relativos a la estructura de las fitasas pueden ser útiles asimismo, tales como el peso molecular (PM), el punto isoeléctrico (pl), o la secuencia peptídica. Para que se puedan utilizar en la alimentación animal, las fitasas deben poseer unas propiedades compatibles con los tratamientos que sufren los alimentos destinados a esta alimentación. En particular, la actividad de las fitasas utilizadas debe mantenerse y si es posible, ser óptima en las condiciones de temperatura y de pH de los procedimientos de preparación de estos alimentos así como en las presentes en el tracto digestivo de los animales que ingieren estos alimentos. Estas obligaciones conducen principalmente a buscar unas fitasas cuya actividad resiste a unas condiciones de temperatura elevada, tales como las utilizadas en los procedimientos de preparación de las composiciones alimenticias, y a unas condiciones de pH ácido, tales como las presentes en el tracto digestivo de los animales de cría.

Con el fin de responder a estos criterios, se han buscado unas fitasas en unos organismos, en particular unos microorganismos, que se desarrollan en unos medios cuyas condiciones de temperatura y de pH corresponden a estos criterios. Esta estrategia ha permitido aislar unas fitasas resistentes a unas temperaturas elevadas, tales como, por ejemplo, las descritas en las solicitudes de patente WO 97/305016 o EP 0 684 313, pero también unas fitasas que poseen un bajo Km, tales como, por ejemplo las descritas en la solicitud de patente EP 0 960 934. Otra estrategia consistió en modificar artificialmente la secuencia de fitasas conocidas mediante mutagénesis dirigida con el fin de conferirle unas propiedades interesantes. Esta estrategia se ha descrito en particular en las solicitudes de patente WO 99/48380, EP 0 897 985 y EP 0 897 010.

Sólo se han identificado algunas fitasas activas a un bajo pH óptimo. Dichas fitasas han sido identificadas en particular en los hongos, tales como la fitasa de Penicillium caseicolum descrita en la solicitud de patente JP 7067635 y la de Monascus anka descrita en la solicitud de patente WO 98/13480, pero también en las levaduras, como la fitasa de Schwaniiomyces occidentalis descrita en la solicitud de patente EP 699 762. Sin embargo, hasta ahora, ninguna bacteria ha conducido al aislamiento y a la identificación de una fitasa que posee un óptimo de pH bajo, en particular un pH óptimo inferior a 4.

Descripción de las figuras

Figura 1: Actividad de la fitasa de Acidocella aminolytica ATCC 51361 en función de la temperatura. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad...

1. Polinucleótido aislado que codifica para una fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo constituido por:

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque está representado por el identificador de secuencia SEC ID nº 1.

3. Polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque procede de una bacteria del género Acidocella.

4. Polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Fitasa caracterizada porque está codificada por un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 4, presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4.

6. Fitasa según la reivindicación 5, caracterizada porque se selecciona de entre el grupo constituido por:

7. Fitasa según una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada porque procede de una bacteria del género Acidocella.

8. Gen quimérico que comprende por lo menos, unidos entre sí de manera operativa:

9. Gen quimérico según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende, además, un péptido señal o un péptido de tránsito funcional en dicho organismo hospedante.

10. Vector de expresión o de transformación que contiene un gen quimérico según una de las reivindicaciones 8 ó 9.

11. Vector según la reivindicación 10, caracterizado porque es un plásmido, un fago o un virus.

12. Organismo hospedante transformado que contiene un vector según la reivindicación 10.

13. Organismo hospedante según la reivindicación 12, caracterizado porque se trata de un microorganismo.

14. Organismo hospedante según la reivindicación 13, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de entre las bacterias, los hongos, las levaduras o los virus.

15. Organismo hospedante según la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria seleccionada de entre los géneros Corynebacterium, Streptomyces y Escherichia, en particular E. coli.

16. Organismo hospedante según la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo es un hongo seleccionado de entre los géneros Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium y Trichoderma.

17. Organismo hospedante según la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo es una levadura seleccionada de entre los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces y Pichia.

18. Organismo hospedante según la reivindicación 12, caracterizado porque se trata de una célula vegetal, de una planta o de una parte de planta.

19. Extracto bacteriano que comprende por lo menos una actividad fitasa, caracterizado porque procede de una bacteria del género Acidocella y cuyo pH óptimo de actividad de dicha actividad fitasa es inferior o igual a 4.

20. Extracto bacteriano según la reivindicación 19, caracterizado porque la actividad fitasa posee las propiedades siguientes:

21. Extracto bacteriano según la reivindicación 19, caracterizado porque la actividad fitasa posee las propiedades siguientes:

22. Procedimiento de preparación de un extracto bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

23. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

24. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

25. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

26. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

27. Composición enzimática, caracterizada porque comprende por lo menos un extracto bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21.

28. Composición enzimática, caracterizada porque comprende por lo menos una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7.

29. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos un organismo hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a 18.

30. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos una bacteria del género Acidocella que expresa una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7.

31. Composición alimenticia según la reivindicación 30, caracterizada porque la bacteria se selecciona de entre las especies Acidocella aminolytica y Acidocella facilis.

32. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos un extracto bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21.

33. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7.

34. Utilización de una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33, para la alimentación de los animales monogástricos.

35. Utilización de una composición alimenticia según la reivindicación 34, caracterizada porque está destinada a la alimentación de los cerdos.

36. Utilización de una composición alimenticia según la reivindicación 34, caracterizada porque está destinada a la alimentación de las aves de corral.

37. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

38. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 30 ó 31, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

39. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 32, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

40. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

41. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

42. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

43. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

44. Procedimiento para aumentar la asimilación del fosfato inorgánico contenido en el ácido fítico de los alimentos a base de vegetales por los animales monogástricos, caracterizado porque se incorpora una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7 o una composición enzimática según una de las reivindicaciones 27 y 28 en la alimentación de dichos animales.

45. Procedimiento según la reivindicación 44, caracterizado porque se alimenta a dichos animales monogástricos con una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33.

46. Procedimiento para disminuir la adición de fósforo en la alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque se alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33.

47. Procedimiento para disminuir las emisiones de fósforo procedentes de la alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque se alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33.