MUTANTES DE GRB7 Y GRB7V CON ACTIVIDAD ANTIANGIOGENICA Y SU USO EN PROCEDIMIENTOS BIOMEDICOS.

Mutantes de Grb7 y Grb7V con actividad antiangiogénica y su uso en procedimientos biomédicos.

La invención proporciona mutantes de la proteína adaptadora Grb7 humana y de su variante natural Grb7V, ambas carentes de un dominio funcional implicado en la unión de la calmodulina, Grb7 y Grb7V, y medios condicionados derivados de células transfectadas por Grb7 y Grb7V·con actividad biológica, incluyendo entre otras la modulación positiva o negativa de la angiogénesis, la motilidad celular y la proliferación celular, así como otras funciones necesarias para la supervivencia, progresión e invasión metastásicas de los tumores, así como los factores presentes en los mismos responsables de dichas actividades

Mutantes de Grb7 y Grb7V con actividad antiangiogénica y su uso en procedimientos biomédicos.

Sector de la técnica

El objeto de la presente invención se puede enclavar en el sector Biomédico y Farmacéutico. Concretamente, estos mutantes y los medios condicionados derivados de células transfectadas con los mismos así como los factores con actividad biológica que contienen tienen utilidad como agentes terapéuticos antitumorales en la angiogénesis asociada al cáncer, así como su uso en otras patologías proliferativas y en reparación de heridas traumáticas y/o quirúrgicas. Por otro lado, los oligonucleótidos producidos en esta invención y el péptido derivado de la misma tienen utilidad diagnóstica.

Estado de la técnica

Las proteínas adaptadoras no poseen actividad enzimática propia, sin embargo intervienen en las vías de señalización intracelular actuando como elementos de reclutamiento, anclaje y transmisión de señal entre diversos componentes de dicha vías, por ejemplo entre receptores mitogénicos como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y moléculas efectoras como proteínas intercambiadoras de GDP por GTP (GEF) en proteínas G de la familia Ras. Una característica de las proteínas adaptadoras es que intervienen en múltiples vías de señalización y funciones celulares.

La familia de proteínas adaptadora Grb7, está formada por tres miembros conocidos hasta la fecha: Grb7, Grb10 y Grb14 [Daly R.J. 1998, Cell. Signal. 10, 613-618; Han D.C. et al., 2001, Oncogene 20, 6315-6321; Villalobo A. et al., 2003, Curr. Topics Biochem. Res. 5, 105-114]. La proteína Grb7 de 58 kDa tiene una estructura modular compuesta por un dominio rico en prolina (PR) en su N-terminal, una región central denominada GM (nombre derivado de proteínas Gbr y la proteína homóloga Mig10 de Caenorabditis elegans) y un dominio SH2 (Src homology domain 2) en su extremo C-terminal. La región GM comprende a su vez un dominio de asociación a Ras (RA) en su parte proximal, un dominio de homología a pleckstrina (PH) en su parte central, y un dominio denominado BPS (nombre derivado de between PH y SH2) o también llamado dominio PIR por algunos autores (nombre derivado de phosphorylated insulin receptor-interacting region) [Daly R.J. 1998, Cell. Signal. 10, 613-618; Han D.C. et al., 2001, Oncogene 20, 6315-6321; Villalobo A. et al., 2003, Curr. Topics Biochem. Res. 5, 105-114].

La proteína Grb7 se expresa en múltiples tejidos e interviene en las vías de señalización del receptor ErbB2 [Stein D et al., 1994, EMBO J. 13, 1331-1340; Janes P.W. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 8490-8497], el EGFR [Kasus-Jacobi A et al., 2000, Oncogene 19, 2052-2059], el receptor ErbB3 [Fiddes RJ et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, 7717-7724], el receptor ErbB4 [Fiddes RJ et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, 7717-7724], el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) [Yokote K et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 30942-30949], el receptor Tek/Tie2 [Jones N et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 30896-30905], el receptor del factor de stem cells c-Kit [Thömmes K et al., Biochem. J. 341, 211-216], el receptor de la insulina [Kasus-Jaconi A et al., 2000, Oncogene 19, 2052-2059], el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) [Kasus-Jaconi A et al., 2000, Oncogene 19, 2052-2059], el receptor Ret [Kasus-Jaconi A et al., 2000, Oncogene 19, 2052-2059; Pandey A et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 10607-10610], el receptor EphB1 [Han D.C. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 45655-45661], la quinasa de la adhesiones focales (FAK) [Han D.C. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 24425-24430], la fosfoproteína Shc [Stein D et al., 1994, EMBO J. 13, 1331-1340; Yokoe K et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 30942-30949] y la proteína-tirosina fosfatasa SHPTP2 [Keegan K and Cooper J.A., 1996, Oncogene 12, 1537-1544].

Entre las funciones bien establecidas de Grb7 está su participación en procesos de migración celular [Daly R.J. 1998, Cell. Signal. 10, 613-618; Han D.C. et al., 2001, Oncogene 20, 6315-6321; Villalobo A. et al., 2003, Curr. Topics Biochem. Res. 5, 105-114]. Además, es bien conocido que Grb7 se sobreexpresa junto al receptor ErbB2 en diversos adenocarcinomas como es el caso paradigmático del cáncer de mama [Stein D et al., 1994, EMBO J. 13, 1331-1340; Kauraniemi P et al., 2001, Cancer Res. 61, 8235-8240], de esófago [Tanaka S et al., 1997, Cancer Res. 57, 28-31] y de estómago [Vans A et al., 2002, Cancer Res. 62, 2625-2629], y sin expresión de ErbB2 en el cáncer testicular de células germinales [Skotheim R.I. et al., 2002, Cancer Res. 62, 2359-2364]. Por otro lado, la expresión en carcinomas de esófago de una variante de la proteína Grb7 carente del dominio SH2 en su extremo C-terminal y denominada Grb7V se correlaciona con invasión fuera de la mucosa y la diseminación metastásica de estos tumores [Tanaka S. et al., 1997, Cancer Res. 57, 28-31; Tanaka S et al., 1998, J. Clin. Invest. 102, 821-827; Tanaka S. et al., 2000, J. Cell. Physiol. 183, 411-415].

Dado que los diversos miembros de la familia Grb7 de proteínas: Grb7, Grb10, Grb14, e incluso la proteína Mig10 de C. elegans, contienen un segmento que tiene las características de un dominio potencial de unión a la calmodulina (CaM-BD) localizado en el dominio PH [Villalobo A. et al., 2002, Curr. Topics Biochem. Res. 5, 105-114], se demuestra posteriormente que Grb7 y Grb7V unen calmodulina y consecuentemente en esta invención preparamos vectores de expresión de mutantes deleccionados mediante mutagénesis dirigida mediada por oligonucleótidos [Sambrook, J., Fritisch, E. F., and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Taylor, J.W., et al. (1985) Nucleic Acid Res. 13: 8765-8785; Vandeyar, M.A., et al. (1988) Gene 65: 129-133; Sugimoto, M., et al. (1989) Anal. Biochem. 179: 309-311; Nelson, M., and McClellan, M. (1992) Methods Enzymol. 216: 279-303; Weiner, M.P., et al. (1994) Gene 151: 119-123; Coste, G.L., and Weiner, M.P. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2423; Schoettlin, W., et al. (1993) Strategies 6: 43-44; Weiner, M.P., and Scheraga, H.A. (1989) Comput. Appl. Biosci. 5: 191-198] de ambas proteínas que denominamos Grb7?(241-256) y Grb7V?(243-256) y de forma abreviada Grb7? y Grb7V?, nomenclatura que utilizaremos de aquí en adelante, demostrando que pierden su capacidad de unir calmodulina y que células transfectadas con dichos mutantes tienen actividad anti-angiogénica. Así, son objeto de esta invención tanto los vectores de expresión de Grb7? y Grb7V? cualquiera que sea su naturaleza (bacterianos, células eukariotas o víricos), las proteínas Grb7? y Grb7V? incluyendo sus formas modificadas por sondas fluorescentes o radioactivas entre otras, proteínas quimeras de Grb7? y Grb7V?, cualquiera que sea su naturaleza, el péptido correspondiente al CaM-BD de Grb7 y Grb7V incluyendo sus formas modificadas por sondas fluorescentes, hidrofóbicas o radioactivas entre otras incluyendo su forma libre así como su forma inmovilizada en un gel o matriz, anticuerpos derivados de dicho péptido, los medios condicionados por células transfectadas con los vectores de expresión de Grb7? y Grb7V? (HEK293T, COS-7 entre otras) incluyendo sus principios activos con propiedades biológicas, entre otros los responsables directos o indirectos de la actividad moduladora de la angiogénesis, incluyendo tanto factores pro-angiogénicos como factores anti-angiogénicos; actividad moduladora de la motilidad celular, incluyendo tanto factores activadores como factores inhibidores; factores moduladores de la proliferación celular, incluyendo tanto factores activadores como factores inhibidores; y factores moduladores de otras funciones necesarias para la supervivencia, progresión e invasión metastásicas de los tumores. Una revisión exhaustiva de los bancos de datos revelan que ninguno de los mutantes producidos por los inventores han sido previamente patentados y por ello el interés en incluir los mutantes Grb7? y Grb7V? y todos los productos derivados de los mismos que se indican de la presente invención entre las herramientas disponibles para la elaboración de nuevos procedimientos biológicos, biomédicos y de aplicación farmacológica terapéutica médica y veterinaria, como reactivos y/o fármacos disponibles comercialmente.

Breve...

1. Péptido caracterizado por la secuencia RKLWKRFFCFLRRS (SEQ ID NO 4), correspondiente al dominio de unión a la calmodulina (CaM-BD) de las proteínas Grb7 y Grb7V humanas, y comprendido entre los residuos 243 y 256 ambos inclusive.

2. Proteína delecionada en su dominio de unión a la calmodulina (CaM-BD) caracterizada porque pertenece al siguiente grupo: proteína Grb7? (SEQ ID NO 7), y proteína Grb7V? (SEQ ID NO 8) así como sus formas quimeras cualquiera que sea su naturaleza, entre otras: EYFP-Grb7?, EYFP-Grb7V?, Grb7?-EYFP, y Grb7V?-EYFP; YFP-Grb7?, YFP-Grb7V?, Grb7?-YFP, y Grb7V?-YFP; GFP-Grb7?, GFP-Grb7V?, Grb7?-GFP y Grb7V?-GFP; EGFP-Grb7?, EGFP-Grb7V?, Grb7?-EGFP y Grb7V?- EGFP; CFP-Grb7?, CFP-Grb7V?, Grb7?-CFP y Grb7V?-CFP; RFP-Grb7?, RFP-Grb7V?, Grb7?-RFP y Grb7V?-RFP.

3. Vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia codificadora de una proteína delecionada según la reivindicación 2, o sus correspondientes secuencias transcripcionales de mRNA, o secuencias translacionales de proteína en cualquiera de sus formas, incluyendo entre otros, vectores de expresión en bacterias, levaduras, hongos, células de planta, insectos y mamíferos incluyendo las humanas, así como vectores víricos y retrovirales.

4. Bacteria caracterizada porque comprende un vector de expresión según la reivindicación 3 o una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína delecionada según la reivindicación 2.

5. Célula eucariota, tales como hongos y levaduras, células de plantas, insectos y mamíferos incluyendo las humanas, transfectada de forma estable o transitoria, caracterizada porque comprende un vector de expresión según la reivindicación 3 o una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína delecionada según la reivindicación 2.

6. Oligonucleótido caracterizado porque pertenece al siguiente grupo: oligonucleótido SEQ ID NO 5 y oligonucleótido SEQ ID NO 6 que anillan con las regiones flanqueantes codificadoras del dómino de unión a la calmodulina (CaM-BD) de Grb7 y Grb7V utilizados para la preparación de los mutantes delecionados Grb7? y Grb7V?.

7. Oligonucleótido caracterizado porque pertenece al siguiente grupo: oligonucleótido SEQ ID NO 1, oligonucleótido SEQ ID NO 2 y oligonucleótido SEQ ID NO 3, utilizados para la amplificación por PCR de las fases de lectura de Grb7 y Grb7V.

8. Medio condicionado por células transfectadas con Grb7? y Grb7V? así como, entre otros, los factores con actividad biológica que contienen responsables directos o indirectos de la modulación de la angiogénesis, tanto factores pro-angiogénicos como anti-angiogénicos; factores moduladores de la motilidad celular, incluyendo tanto factores activadores como factores inhibidores; factores moduladores de la proliferación celular, incluyendo tanto factores activadores como factores inhibidores; así como factores moduladores de otras funciones necesarias para la supervivencia, progresión e invasión metastásicas de los tumores.

9. Anticuerpo, ya sea monoclonal o policlonal, caracterizado porque reconoce el péptido según la reivindicación 1.

10. Uso de cualquiera de los productos de las reivindicaciones de la 1 a la 9 en la preparación de un medicamento antitumoral o agente terapéutico de otras patologías proliferativas y de reparación de heridas traumáticas y/o quirúrgicas.

11. Uso de cualquiera de los productos de las reivindicaciones de la 1 a la 9 en el diagnóstico in vitro de patologías proliferativas.