Anticuerpo recombinante que comprende:

(i) un dominio de unión que es capaz de unirse a una molécula objetivo;

y

(ii) un dominio efector;

en el que el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula objetivo sin activar una lisis dependiente del complemento significativa, o destrucción celular mediada del objetivo,

y en el que el dominio efector es

- capaz de unirse específicamente a Fc?RIIb, y

- un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, cuyas inmunoglobulinas humanas se seleccionan entre IgG1, IgG2 e IgG4,

y en donde el dominio quimérico es un dominio CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones indicadas: 233P, 234V, 235A y 236G 327G y, 330S y 331 S según el sistema de numeración de la UE,

y es al menos un 98% idéntico a una secuencia CH2 (residuos 231-340) de la IgG1, IgG2 o IgG4 humana que tiene dichos aminoácidos modificados

Moléculas de unión derivadas de inmunoglobulinas que no activan la lisis mediada de complemento.

Campo técnico

La presente invención se refiere a polipéptidos de unión que tienen secuencias de aminoácidos derivadas de una región constante modificada de la inmunoglobulina G (IgG) de cadena pesada. La invención se refiere además a procedimientos y materiales para la producción de dichos polipéptidos, y a procedimientos y materiales que los emplean.

Estado de la técnica

Inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas son glicoproteínas que ayudan a defender al huésped contra la infección. Generalmente se trata de las cadenas pesadas y ligeras, cuyos dominios N-terminal forman un dominio variable o V capaz de la unión del antígeno. El dominio V se asocia con un dominio constante o C-terminal que define la clase (y en ocasiones subclase [isotipo], y alotipo [isoalotipo]) de la inmunoglobulina.

Así, en especies de mamíferos existen inmunoglobulinas como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. La clase IgG a su vez, existe como cuatro subclases en humanos (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). El C-dominio en IgG se compone de tres dominios C?1, C?2 y C?3, que son muy similares entre estas subclases (más del 90% de homología). Los dominios C?1 y C?2 están unidos por una bisagra. El papel de las subclases parece variar entre las especies.

Se sabe que el C-dominio es responsable de diversas funciones efectoras de las inmunoglobulinas (véase Clark (1997) "IgG Effector Mechanisms" en "Antibody Engineering" Ed. Capra, pub. Immunol Chem, Basilea, Kurger, Vol. 65 pp 88-110, para una revisión detallada).

Brevemente, las funciones de IgG se logran generalmente a través de la interacción entre la región Fc de Ig y un receptor de Fc? (Fc?R) u otra molécula de unión, a veces en una célula efectora. Esto puede desencadenar que las células efectoras maten a las células objetivo a las que los anticuerpos se enlazan a través de sus regiones variables (V). También anticuerpos dirigidos contra antígenos solubles pueden formar complejos inmunes que se dirigen a Fc?Rs resultando en la adopción (opsonización) de los complejos inmunes o en la activación de las células efectoras y la liberación de citocinas.

En los seres humanos, se han caracterizado tres clases de Fc?R, aunque la situación se complica aún más por la aparición de múltiples formas receptoras. Las tres clases son:

(i) Fc?RI (CD64) une a la IgG monomérica con gran afinidad y se expresa en macrófagos, monocitos y neutrófilos y a veces en eosinófilos.

(ii) Fc?RII (CD32) se une un complejo IgG de afinidad media a baja y se expresa ampliamente. Estos receptores se pueden dividir en dos tipos importantes, Fc?RIIa y Fc?RIIb.

La forma "a" del receptor se encuentra en muchas células implicadas en la muerte (macrófagos, por ejemplo, monocitos, neutrófilos) y parece capaz de activar el proceso de la muerte, y se presenta como dos alelos alternativos.

La forma "b" parece jugar un papel en los procesos inhibitorios y se encuentra en las células B, macrófagos y mastocitos y eosinófilos. En las células B parece funcionar para suprimir la producción de inmunoglobulinas y el cambio de isotipo a, por ejemplo, la clase IgE. En macrófagos, la forma b actúa para inhibir la fagocitosis mediada a través Fc?RIIa. En los eosinófilos y los mastocitos la forma b puede ayudar a suprimir la activación de estas células a través de fijación de IgE a su receptor separado.

(iii) Fc?RIII (CD16) se une a IgG con afinidad media a baja y existe como dos tipos. Fc?RIIIa se encuentra en células NK, macrófagos, eosinófilos y algunos monocitos y las células T y media la ADCC. Fc?RIIIb está altamente expresada en los neutrófilos. Ambos tipos tienen diferentes formas alotípicas.

Además de la unión a Fc?Rs, los anticuerpos IgG pueden activar el complemento y esto también puede dar lugar a la lisis celular, o en opsonización o en liberación de citoquinas e inflamación. La región Fc también media en propiedades tales como el transporte de IgG en el neonato (a través de la llamada "FcRn"); aumento de vida media (también se cree que se efectúan a través de un receptor de tipo FcRn - ver Ghetie y Ward (1997) Immunology Today 18, 592-598) y la auto-agregación. La región FC es también responsable de la interacción con la proteína A y la proteína G (cuya interacción parece ser análoga a la unión de FcRn).

Ingeniería de inmunoglobulinas

Muchos de los receptores propiedades mediadas por Fc mencionados anteriormente pueden ser deseables en anticuerpos construidos de forma natural o artificialmente. Sin embargo, hay circunstancias en que, en particular, la muerte celular, o la liberación de citoquinas y la consiguiente inflamación, es inadecuada e indeseable.

Del mismo modo, sin embargo, puede ser conveniente mantener ciertas funciones mediadas por Fc, por ejemplo, la larga vida media plasmática.

Se sabe que la IgG4 humana, por ejemplo, no activa el complemento y la IgG2 humana no se une al receptor Fc?RI de alta afinidad y entonces éstas han sido previamente utilizadas en algunas situaciones (proteína de fusión receptor de TNF se realizó con IgG4 Fc).

Sin embargo, ninguna subclase humana carece de todas las funciones activadoras del efector Fc pertinentes o la activación del complemento en todas las circunstancias, posiblemente debido a la existencia de las diversas formas de las Fc?Rs. Así, por ejemplo, IgG4 puede desencadenar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en algunas personas y IgG2se une a una forma alélica del receptor Fc?RIIa y también activa el complemento.

Un enfoque alternativo se ha de mutar la secuencia Fc para sustituir residuos cruciales para la función. Algunos residuos objetivo han sido identificados y publicados (véase la revisión de Clark 1997, supra). Estos incluyen los carbohidratos N-enlazados unidos al sitio conservado en el dominio C_H2, ciertos residuos en la región de la bisagra inferior (por ejemplo, la secuencia ELLGGP) y un residuo de prolina en la posición 331 y una secuencia E-x-K-x-K en las posiciones 318-322. Un ejemplo reciente es divulgado por Cole et al (1997) Journal of Immunology 159, 3613 a 3621. En la divulgación, los residuos 234, 235 y 237 fueron mutados a alaninas (o en el caso de 235, a veces a Glu). Sin embargo, estos son todos los residuos inusuales en estas posiciones en la IgG humana, por lo tanto la presencia de estos aminoácidos inadecuados puede hacer que el Fc más inmunogénico o antigénico y también puede conducir a la pérdida de ciertas funciones Fc deseables.

Una vez más esta estrategia se ha utilizado para la construcción de un anticuerpo CD3 aglicosilado terapéutico (véase Routledge et al, 1993 Eur J Immunol 23: 403-411, Véase también Reino Unido PA 9206422.9) y para un anticuerpo CD18 inhibidor. Sin embargo una desventaja de aquí es que las nuevas construcciones recombinantes tienen secuencias inusuales y pueden ser reconocidas y rechazadas por el sistema inmune como extrañas. Los anticuerpos aglicosilados carecen también de unión al receptor inhibitorio Fc?RIIb, mientras que el mantenimiento de esta unión puede ser ventajoso para algunas aplicaciones.

Otros enfoques para la modificación de las inmunoglobulinas se exponen en WO 92/16562 (Lynxvale Ltd), que analiza la modificación del alotipo del anticuerpo humanizado IgG1 CAMPATH1H que tiene afinidad de unión por el antígeno CD52. El antígeno CD52 se encuentra en los linfocitos y monocitos humanos y se ha utilizado como objetivo terapéutico para el tratamiento de linfomas de células T y B y leucemias, inmuno-supresión de receptores de trasplante de órganos y médula ósea y también el tratamiento de algunos desórdenes autoinmunes y afines, tales como artritis reumatoide y la vasculitis sistémica.

Morgan et al (1995) Inmunology 86: 319-324 describe ciertos mutantes IgG1 e IgG4 y las prueba para Fc?RI, Fc?RIII y actividad del complemento. Entre los mutantes probados fue G1[L235A] el que mostró para demostrar niveles relativamente altos de ADCC en comparación con otros mutantes (Tabla 2, página 321).

La patente WO 95/05468 (Lynxvale Ltd) también dio a conocer la modificación de determinantes alotípicos en Igs (o derivados) con las funciones de unión u otras efectoras deseadas.

Puede verse en lo anterior que la provisión de procedimientos o materiales que faciliten la ingeniería de las regiones Fc, tales como para reducir los efectos no deseados, mientras se mantienen...

1. Anticuerpo recombinante que comprende:

(i) un dominio de unión que es capaz de unirse a una molécula objetivo; y

(ii) un dominio efector;

en el que el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula objetivo sin activar una lisis dependiente del complemento significativa, o destrucción celular mediada del objetivo,

y en el que el dominio efector es

- capaz de unirse específicamente a Fc?RIIb, y

- un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, cuyas inmunoglobulinas humanas se seleccionan entre IgG1, IgG2 e IgG4,

y en donde el dominio quimérico es un dominio C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones indicadas: 233P, 234V, 235A y 236G 327G y, 330S y 331 S según el sistema de numeración de la UE,

y es al menos un 98% idéntico a una secuencia C_H2 (residuos 231-340) de la IgG1, IgG2 o IgG4 humana que tiene dichos aminoácidos modificados.

2. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en el que el dominio efector es G1?ac que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

3. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en el que el dominio efector es G4?c que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

4. Anticuerpo recombinante que comprende:

(i) un dominio de unión que es capaz de unirse a la molécula objetivo, y

(ii) un dominio efector;

en el que el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula objetivo sin activar una lisis dependiente complemento significativa, o la destrucción celular mediada del objetivo,

y en el que el dominio efector es

- capaz de unirse específicamente a Fc?RIIb, y

- un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, cuyas inmunoglobulinas humanas se seleccionan entre IgG1, IgG2 e IgG4,

y en el que el dominio quimérico es un dominio C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones indicadas: 233P, 234V, 235A y ningún residuo en 236, y 327G, 330S y 331S según el sistema de numeración de la UE,

y es al menos un 98% idéntico a una secuencia C_H2 (residuos 231-340) de IgG1 o IgG2 humana que tiene dichos aminoácidos modificados.

5. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 4, en el que el dominio efector es G1?ab que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

6. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 4, en el que el dominio efector es G2?a que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

7. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores

en el que el dominio efector se deriva de un primer dominio C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, donde al menos el 1 amino ácido en al menos 1 región del dominio C_H2 ha sido modificado al aminoácido correspondiente de un segundo dominio C_H2, diferente, de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y

en el que el dominio efector tiene una afinidad reducida para Fc?RI, Fc?RIIa o Fc?RIII y una capacidad reducida para mediar la lisis por complemento en comparación con el primer o segundo dominio C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

8. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de unión se deriva de una fuente diferente a la del dominio efector.

9. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de unión es capaz de unirse cualquiera de: el antígeno RhD de glóbulos rojos; un aloantígeno HPA plaquetario; un antígeno de neutrófilos; un receptor de células T; integrina; colágeno GBM, y Der P1; HPA-1a; VAP-1; laminina; luterano; glicoproteína plaquetaria VI; glicoproteína plaquetaria Ia/IIa.

10. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 9, en el que el dominio de unión se selecciona entre CAMPATH-1 y FOG1; OKT3; B2 (anti-HPA-1a); VAP-1; anti-a3 (IV) NC1 murino; YTH12.5 (CD3); 2C7 (anti-Der p I); anti-laminina, anti-luterana.

11. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio efector del anticuerpo recombinante tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

12. Ácido nucleico según la reivindicación 11, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Ácido nucleico según la reivindicación 11 ó la reivindicación 12, que es un vector replicable.

14. Ácido nucleico según la reivindicación 13, en el que la secuencia de nucleótidos está operativamente vinculada a un promotor.

15. Célula huésped que comprende o transformada con el vector de la reivindicación 13 o la reivindicación 14.

16. Procedimiento para producir un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo el procedimiento la etapa de modificar una secuencia de nucleótidos que codifica una primera cadena pesada C_H2 de inmunoglobulina humana, de manera que 2, 3 ó 4 aminoácidos en al menos 1 región del dominio C_H2 corresponden a un aminoácido de un segundo dominio C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en el que la región se selecciona entre las 2 regiones discretas numeradas de residuos 233-236, y 327-331 según el sistema de numeración de la UE, y en donde en cada caso la inmunoglobulina humana se selecciona entre IgG1, IgG2 e IgG4.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que 2 aminoácidos en 1 región del dominio C_H2 se modifican a los aminoácidos correspondientes de un segundo dominio C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que por lo menos 2 aminoácidos en cada una de las 2 regiones discretas del dominio C_H2 se modifican a los aminoácidos correspondientes en la región correspondiente en un segundo y tercer dominio C_H2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana respectivamente.

19. Utilización in vitro de un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para unir la molécula objetivo con dicho dominio de unión.

20. Utilización según la reivindicación 19, en el que el dominio efector se une específicamente a Fc?RIIb y cuya unión provoca la inhibición de uno o más de: activación de células B; degranulación de los mastocitos; fagocitosis.

21. Utilización según la reivindicación 19, para prevenir, inhibir, o interferir con la unión de una segunda molécula de unión a la molécula objetivo.

22. Utilización según la reivindicación 21, en la que la segunda molécula de unión es un anticuerpo.

23. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que la molécula objetivo se selecciona entre: el antígeno RhD de glóbulos rojos; un aloantígeno plaquetario HPA; un antígeno de neutrófilos; un receptor de células T; integrina; colágeno GBM; Der P1; HPA-1a; VAP-1; laminina; luterano; glicoproteína plaquetaria VI; glicoproteína plaquetaria Ia/IIa.

24. Utilización de un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente para un trastorno, en la que dicho dominio de unión de dicho anticuerpo recombinante se utiliza en dicho tratamiento para unirse a la molécula objetivo que está asociada con dicho trastorno,

en la que el trastorno y la molécula objetivo se seleccionan entre:

(i) la enfermedad de injerto contra huésped o enfermedad de huésped contra injerto o rechazo del trasplante de órganos o rechazo de trasplante de médula ósea o vasculitis autoinmune o artritis o asma, en la que la molécula objetivo es un receptor de células T;

(ii) anemia hemolítica autoinmune o trombocitopenia autoinmune, en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en antígenos de glóbulos rojos Rhesus D, C, c, E, e; antígeno Kell (K1); glucoproteína plaquetaria IIb/IIIa, GPIb/IX/V;

(iii) trombocitopenia aloinmune fetal/neonatal; en la que la molécula objetivo es antígeno plaquetario humano (HPA)-1a sobre la glucoproteína plaquetaria IIIa;

(iv) alergia del ácaro del polvo, en la que la molécula objetivo es proteína Der P1 del ácaro del polvo doméstico Dermatophagoides pteronyssinus;

(v); Crohn, en la que la molécula objetivo es VAP-1;

(vi) HDN, en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo formado por antígenos de glóbulos rojas Rhesus D, C, c, E, e, o antígeno Kell (K1);

(vii) síndrome de Goodpastures; en el que la molécula objetivo es un dominio no colágeno (NC1) de colágeno a3 (IV);

(viii) anemia de células falciformes, en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: trombospondina, laminina, luterana;

(ix) oclusión de la arteria coronaria en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: integrina a₂ß₁ (glicoproteína plaquetaria Ia/IIa), glicoproteína plaquetaria VI no-integrina.

25. Utilización según la reivindicación 24, en la que el medicamento es para la administración a un paciente que es un bebé por nacer, y el medicamento se administra a la madre del paciente.

26. Preparación farmacéutica que comprende un anticuerpo recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 10, o un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, más un portador farmacéuticamente aceptable.

27. Preparación farmacéutica según la reivindicación 26, para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico.

28. Región C_H2 de anticuerpo que es G1?ac que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

29. Región C_H2 de anticuerpo que es G1?ab que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

30. Región C_H2 de anticuerpo que es G2?a que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: