Método para el aislamiento de una célula endotelial precursora a partir de una muestra biológica,

que comprende:

(a) la puesta en contacto de una muestra que contiene, o que se sospecha que contiene una célula endotelial precursora, con un reactivo de detección para formar un complejo de reactivo de detección-célula endotelial precursora, y

(b) separar el complejo de reactivo de detección-célula endotelial precursora de la muestra biológica, aislando de esta manera la célula endotelial precursora,

en el que el reactivo de detección es un anticuerpo específico contra Tie-2, y

en el que la célula endotelial precursora es negativa para CD34

Métodos de ensayo de compatibilidad cruzada específica de donante.

Campo de la invención

La invención se refiere a un método para el aislamiento directo de células endoteliales a partir de sangre completa, para la detección específica de compatibilidad cruzada específica de donante para detectar anticuerpos anti-células endoteliales previamente al trasplante de un órgano.

Antecedentes de la invención

La presencia de anticuerpos específicos de antígeno leucocitario humano (HLA) reactivos con linfocitos humanos se ha asociado antes y/o después del trasplante de aloinjerto renal con rechazos hiperagudos, rechazos agudos tempranos y pobre supervivencia del injerto. Sin embargo, pueden producirse rechazos en ausencia de anticuerpos linfocitotóxicos detectables, sugiriendo que los sistemas antigénicos no HLA también podrían desempeñar un papel en los rechazos del aloinjerto renal hiperagudo y agudo. Los anticuerpos reactivos con células endoteliales y con monocitos (también denominado sistema antigénico EM) o únicamente con células endoteliales, han sido descritos y se ha informado que presentan un efecto deletéreo en varios trasplantes de órganos.

Recientemente, el antígeno cadena A del complejo de histocompatibilidad mayor de clase I (MICA) expresado en células endoteliales ha sido identificado como uno de los antígenos diana de la inmunidad humoral asociada a rechazos irreversibles de aloinjertos renales. Los estudios de aloinjertos procedentes de donante vivo relacionado que presentan HLA idéntico han demostrado que la presencia de anticuerpos reactivos para células endoteliales/monocitos se correlaciona con el rechazo, la pérdida y una función pobre del aloinjerto. Se ha informado que esta reactividad podría ser responsable de hasta un 80% de los rechazos irreversibles en este grupo de pacientes. Sin embargo, la compatibilidad cruzada de linfocitos (LXM) utilizada rutinariamente no permite el ensayo rutinario de anticuerpos clínicamente relevantes de HLA clase I, clase II, reactivos con endotelio y monocitos, y específicos de células endoteliales. Aunque la presencia de células endoteliales circulantes en sangre completa ha sido debatida durante muchos años, algunos investigadores recientemente han informado de la existencia de células endoteliales precursoras circulantes en seres humanos adultos. Sin embargo, en la actualidad no se dispone de ningún método adecuado para llevar a cabo un ensayo rutinario de compatibilidad cruzada específica de donante de células endoteliales (ECXM).

Por lo tanto, existe una necesidad de llevar a cabo eficientemente un ensayo rutinario de compatibilidad cruzada de células endoteliales específica de donante para ayudar a la identificación de mejores combinaciones de donante-receptor, que de esta manera presentarán un mayor impacto sobre la supervivencia del trasplante que el método actual de identificación de compatibilidad cruzada de linfocitos.

F. GEORGE ET AL., THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS 67(1):147-153, 1992, se refiere al aislamiento rápido de células endoteliales humanas a partir de sangre completa utilizando anticuerpo monoclonal s-endo1 acoplado a perlas inmunomagnéticas y el daño endotelial tras la angioplastia.

ROSELLA SBARBATI ET AL., BLOOD 77(4), 15 de febrero de 1991 (1991-02-15), páginas 764-769, se refiere a la detección inmunológica de células endoteliales en sangre completa humana.

M.K. JONES ET AL., JOURNAL OF PHYSIOLOGY AND PHARMACOLOGY 51(4):813-820, 2000, se refiere al aislamiento y caracterización de células endoteliales microvasculares gástricas de rata como modelo para el estudio de la angiogénesis gástrica in vitro.

MARIO PEICHEV ET AL., BLOOD 95(3):952-958, 1 de febrero de 2000 (2000-02-01) se refiere a la identificación de una población de precursores endoteliales funcionales mediante la expresión de VEGFR-2 y AC133.

Descripción resumida de la invención

La invención se refiere a un método para aislar células endoteliales precursoras que resulten útiles en la identificación de la compatibilidad cruzada específica de donante previamente al trasplante. Las células endoteliales precursoras aisladas también resultan útiles en el diagnóstico de diversos trastornos vasculares y de tipo inmunológico.

La invención incluye un método para aislar una célula endotelial precursora de una muestra biológica mediante la provisión de una muestra que es conocido que contiene, o que se sospecha que contiene, una célula endotelial precursora. La célula endotelial precursora es positiva para Tie-2. La muestra se pone en contacto con un reactivo de detección para formar un complejo de detección de reactivo-célula endotelial. La célula endotelial precursora se aísla mediante la separación del complejo respecto de la muestra. La separación se lleva a cabo, por ejemplo, mediante citometría de flujo o la utilización de un campo magnético.

El reactivo de detección es un anticuerpo específico para Tie-2. El reactivo de detección puede unirse a un soporte sólido, tal como una perla no magnética, magnética o paramagnética.

La muestra biológica es de sangre completa, de suero, de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o producto de leucoféresis.

La invención proporciona además un método para identificar la compatibilidad cruzada entre un donante y un receptor mediante la provisión de una muestra biológica de un donante que es conocido que contiene células endoteliales precursoras y puesta en contacto de la muestra procedente del donante con reactivo de detección para aislar las células endoteliales precursoras. La falta de reactividad entre la muestra del receptor y la célula endotelial precursora aislada indica compatibilidad entre el donante y el receptor y una probabilidad más alta de que el trasplante de órgano resulte exitoso.

En un aspecto adicional, la invención incluye un método para diagnosticar un trastorno vascular o de tipo inmunológico en un sujeto mediante la provisión de una primera muestra procedente de un sujeto que es conocido que contiene, o que se sospecha que contiene, una célula endotelial precursora. La primera muestra se pone en contacto con una segunda muestra. La segunda muestra procede de un sujeto que es conocido que contiene, o que se sospecha que contiene, un autoanticuerpo. Alternativamente, la segunda muestra contiene reactivos (por ejemplo anticuerpos) que reconocen marcadores de superficie celular endotelial asociados al trastorno particular. Se determina la formación de complejo entre la célula endotelial precursora y la segunda muestra. La presencia del complejo indica la presencia del trastorno en el sujeto.

En todavía otro aspecto, la invención incluye un método para determinar la eficacia del tratamiento o el pronóstico de un trastorno de tipo autoinmunológico o vascular en un sujeto mediante la provisión de una primera muestra procedente de un sujeto que es conocido que contiene, o que se sospecha que contiene, una célula endotelial precursora, la puesta en contacto de la célula endotelial precursora con una segunda muestra procedente de un sujeto que es conocido que contiene, o que se sospecha que contiene, un autoanticuerpo, la medición de cualquier complejo de autoanticuerpo-célula endotelial precursora presente, proporcionando un perfil del sujeto. El perfil del sujeto se compara con un perfil de referencia, de manera que la similitud entre los perfiles del sujeto y de referencia indica que el tratamiento resulta eficaz o que el pronóstico es favorable.

Entre los trastornos de tipo autoinmunológico o vasculares se incluyen la vasculitis, la ateroesclerosis, los trastornos hemorrágicos, la angiogénesis, la trombosis, la cicatrización defectuosa de heridas y el trasplante.

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado entendido comúnmente por un experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos indicados en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria, incluyendo definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente,...

1. Método para el aislamiento de una célula endotelial precursora a partir de una muestra biológica, que comprende:

en el que el reactivo de detección es un anticuerpo específico contra Tie-2, y

en el que la célula endotelial precursora es negativa para CD34.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra se selecciona de entre el grupo que consiste de sangre completa, suero, células mononucleares de sangre periférica y producto de leucoféresis.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a un soporte sólido.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el soporte sólido es una perla no magnética, magnética o paramagnética.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la separación se realiza mediante citometría de flujo o en un campo magnético.

6. Método de compatibilidad cruzada de un donante y un receptor, que comprende:

en el que la falta de reactividad de la muestra del receptor con la célula precursora aislada indica compatibilidad entre el donante y el receptor.

7. Método ex vivo para el diagnóstico de un trastorno vascular o de tipo autoinmunológico en un sujeto, que comprende:

en el que la presencia del complejo indica la presencia del trastorno en el sujeto.

8. Método ex vivo para la determinación de la eficacia de tratamiento, o para la evaluación de un pronóstico, de un trastorno vascular o de tipo autoinmunológico en un sujeto, que comprende:

en el que una similitud entre el perfil del sujeto y el perfil de referencia indica que el tratamiento resulta eficaz y un pronóstico favorable para el sujeto.

9. Método según la reivindicación 7 ó 8, en el que el trastorno se selecciona de entre el grupo que consiste de vasculitis, ateroesclerosis, trastornos hemorrágicos, cicatrización defectuosa de heridas y trasplante.