METODO PARA PRODUCIR L-ARGININA, L-ORNITINA O L-CITRULINA.
Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:
1; o
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 y se han suprimido, sustituido o añadido de 1 a 20 radicales de aminoácido en la región en las posiciones 1 a 19 o de 39 a 294 y
que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2005/017877.
Solicitante: KYOWA HAKKO BIO CO., LTD.
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 1-6-1, OHTEMACHI, CHIYODA-KU,TOKYO, 100-8185.
Inventor/es: IKEDA, MASATO, NAKANO,TETSUO,C/O KYOWA HAKKO KOGYO CO.,LTD, MITSUHASHI,SATOSHI,C/O KYOWA HAKKO KOGYO CO.,LTD, HAYASHI,MIKIRO,C/O KYOWA HAKKO KOGYO CO.,LTD, TANAKA,KENJI,C/O KYOWA HAKKO KOGYO CO.,LTD.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 24 de Marzo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/12B2
- C12P13/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Citrulina; Arginina; Ornitina.
Clasificación PCT:
- C07K14/34 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Corynebacterium (G).
- C12N15/00 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
- C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N9/12 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
- C12P13/10 C12P 13/00 […] › Citrulina; Arginina; Ornitina.
Fragmento de la descripción:
Método para producir L-arginina, L-ornitina o L-citrulina.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un proceso para producir L-arginina, L-ornitina o L-citrulina.
Antecedentes de la invención
En los microorganismos, se biosintetiza la L-arginina a partir de ácido L-glutámico a través de ocho etapas de reacción. L-ornitina y L-citrulina son productos intermedios de la ruta de biosíntesis de L-arginina. La biosíntesis de L-arginina, L-ornitina y L-citrulina está regulada de manera similar a la de otros aminoácidos.
En las bacterias corineformes, por ejemplo, la transcripción de un operón compuesto de genes que codifican las enzimas responsables de la biosíntesis de L-arginina (en adelante, abreviado operón de arginina) es reprimida por el represor de arginina (en adelante denominado ArgR) (ver publicación de patente Nº1). Se sabe que en la bacteria corineforme N-acetilglutamato quinasa, que es la segunda enzima en la ruta de biosíntesis a partir de ácido L-glutámico de L-arginina (EC: 2.7.2.8, en adelante a veces abreviado ArgB), está sujeta a la inhibición por retroalimentación a través de L-arginina (ver la publicación no patente Nº 2).
L-arginina, L-ornitina y L-citrulina se producen utilizando microorganismos así como otros aminoácidos, y se han llevado a cabo estudios, como en el caso de otros aminoácidos, para favorecer la productividad de estos aminoácidos a través del uso de medios como mutación y técnicas de ADN recombinante.
Por ejemplo, existe un informe de la obtención de Corynebacterium glutamicum K65 (FERM BP-1115) que tiene una mejor productividad de arginina por transformación de Corynebacterium glutamicum con un fragmento de ADN que contiene un gen responsable de la biosíntesis de arginina y la realización después de mutagénesis (ver publicación de patente Nº 2).
Se han obtenido también por mutagénesis Corynebacterium glutamicum en la que se cancela la represión de las enzimas de la biosíntesis de arginina (ver la publicación no patente Nº 1) y Corynebacterium glutamicum en la que se cancela la represión de las enzimas de la biosíntesis de arginina, se desensibiliza la inhibición por retroalimentación a través de L-arginina y se potencia la permeabilidad de membrana de L-argina (ver la publicación no patente Nº 3).
Se ha obtenido la bacteria corineforme en la que se destruye ADN que codifica ArgR (ver publicación de patente Nº1) a través de técnicas de ADN recombinante.
No obstante, no existe ningún informe hasta la fecha a cerca de qué mutación debería introducirse en el ADN que codifica ArgB o ArgR para obtener una cepa en la que se introduzcan las mutaciones en los dos ADNs que codifican respectivamente ArgB y ArgR y que suponga una mejor productividad de L-arginina.
Publicación de patente Nº1:
Solicitud de patente sin examinar publicada japonesa Nº 51790/02
Publicación de patente Nº 2:
Solicitud de patente sin examinar publicada japonesa Nº 79597/88
Publicación no patente Nº 1:
Agricultural & Biológical Chemistry, vol. 43, p. 105-111 (1979)
Publicación no patente Nº 2:
Journal of Bacteriology, vol. 91, p. 617 (1966)
Publicación no patente Nº 3:
Agricultural & Biological Chemistry, vol. 36, p. 1675-1684 (1972).
Descripción de la invención
Uno de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar un proceso eficiente para producir L-arginina, L-ornitina, o L-citrulina.
La presente invención se refiere a los siguientes puntos (1) a (18):
(1) Un polipéptido que tiene:
(2) Un polipéptido que tiene:
(3) Un polipéptido que tiene:
(4) Un polipéptido que tiene:
(5) Un ADN que codifica el polipéptido con arreglo a uno de los puntos (1) a (4) anteriores.
(6) Un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótido que se presentan en las SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y 12.
(7) Un ADN que se híbrida con ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de ADN que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO:1 en condiciones estrictas, que se selecciona del grupo que consiste en los siguientes puntos (i) a (iii):
Reivindicaciones:
1. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1; o
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 20 a 38 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 y se han suprimido, sustituido o añadido de 1 a 20 radicales de aminoácido en la región en las posiciones 1 a 19 o de 39 a 294 y
que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa.
2. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 1 ó
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos uno o más radicales de aminoácido en la región en las posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 y están suprimidos, sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de aminoácido en la región en las posiciones 1 a 25 o 32 a 294; y
que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa.
3. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos en la que está sustituido un radical de aminoácido en la posición 26 o 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1.
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que están sustituidos los radicales de aminoácido en las posiciones 26 a 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1; o
(iii) una secuencia de aminoácidos en la que están suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos de los puntos (i) o (ii) anteriores de 1 a 20 radicales de aminoácido distintos a los que están en las posiciones sustituidas; y
que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa.
4. Un polipéptido que tiene:
(i) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 y 11;
(ii) una secuencia de aminoácidos en la que están suprimidos, sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de aminoácido distintos al radical 26 en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID NO: 3, 5 y 7;
(iii) una secuencia de aminoácidos en la que están suprimidos, sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de aminoácido distintos al radical 31 en la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 9; o
(vi) una secuencia de aminoácidos en la que están suprimidos, sustituidos o añadidos de 1 a 20 radicales de aminoácido distintos a los radicales 26 a 31 en la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 11; y
que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa.
5. Un ADN que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótida presentadas en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 y 12.
7. Un ADN que tiene un 95% o más de homología con la secuencia de nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 2, que se selecciona del grupo que consiste en los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) ADN que codifica un polipéptido en el que el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácido distinto a L-alanina;
(ii) ADN que codifica un polipéptido en el que el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 31 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácidos distinto a L-metionina; y
(iii) ADN que codifica un polipéptido en el que el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 es un radical de aminoácido distinto a L-alanina y el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 31 es un radical de aminoácido distinto a L-metionina, y
que codifica un polipéptido que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa.
8. El ADN según la reivindicación 7, en el que el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 26 desde el término N de la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 es L-valina, L-leucina o L-isoleucina y el radical de aminoácido que corresponde al radical en la posición 31 es L-valina.
9. Un ADN que tiene un 95% o más de homología con la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 2 que está seleccionado del grupo que consiste en los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos en la que la región que corresponde la la región en las posiciones 76 a 78 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 2 es guanina-timidina-timidina, citosina-timidina-guanina o adenina-timidina-citosina;
(ii) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 91 a 93 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 2 es guanina-timidina-guanina; y
(iii) ADN que tiene una secuencia de nucleótidos en la que la región que corresponde a la región en las posiciones 76 a 78 desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos presentada en la SEQ ID NO: 2 es guanina-timidina-timidina, citosina-timidina-guanina o adenina-timidina-citosina y la región que corresponde a la región en las posiciones 91 a 93 es guanina-timidina-guanina; y
que codifica un polipéptido que tiene actividad N-acetil glutamato quinasa.
10. Un ADN recombinante que se obtiene incorporando el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 en un vector.
11. Un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium que es transformado con el ADN recombinante según la reivindicación 10.
12. Un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium que tiene el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.
13. El microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que la actividad de represión de la transcripción del represor arginina en un operón de arginina está reducida o perdida.
14. El microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la actividad ornitina carbamoil transferasa está reducida o perdida.
15. El microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la actividad arginino succinato sintasa está reducida o perdida.
16. El microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, siendo dicho microorganismo un microorganismo que pertenece a Corynebacterium glutamatum.
17. Un proceso para producir L-arginina, L-ornitina o L-citrulina que comprende el cultivo del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en un medio que permite la formación y acumulación de L-arginina, L-ornitina o L-citrulina en el cultivo, y la recuperación de L-arginina, L-ornitina o L-citrulina desde el cultivo.
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