METODO PARA LA PRODUCCION A GRAN ESCALA DEL DOMINIO KRINGLE 2 MAS SERINA PROTEASA (K2S) DE PLASMINOGENO EN PROCARIOTAS.

Método para la producción de un dominio kringle 2 más proteasa de serina (K2S),

activo y correctamente plegado, del activador de plasminógeno tisular o una variante funcional de éste en el sobrenadante de células procarióticas, caracterizado porque la célula procariótica contiene y expresa un vector que comprende un ADN que codifica el péptido señal de la proteína de la membrana externa A (OmpA), que está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica un péptido corto, caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEGNSD (SEQ ID NO:3), que por sí misma está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica el dominio kringle 2 más proteasa de serina del activador de plasminógeno tisular humano o un derivado funcional de éste

Método para la producción a gran escala del dominio kringle 2 más serina proteasa (K2S) de plasminógeno en procariotas.

El invento se refiere al sector de la producción de proteínas en células procarióticas.

El invento se refiere a métodos para la producción de un dominio kringle 2 más proteasa de serina (K2S) del activador de plasminógeno tisular (tPA) derivado de un ADN recombinante en células procarióticas, en el que dicha K2S se segrega extracelularmente como una proteína activa y correctamente plegada, y la célula procariótica contiene y expresa un vector que comprende el ADN que codifica dicha proteína heteróloga, unido operativamente al ADN que codifica el péptido de señal OmpA.

Técnica de antecedentes

Los sistemas de expresión procarióticos para proteínas heterólogas se usan corrientemente para proteínas que no requieren pautas de glicosilación en mamíferos, puesto que proporcionan una manera barata de producir grandes cantidades de dicha proteína. La formación de una proteína agregada en alto grado o de cuerpos de inclusión se puede encontrar corrientemente en la expresión con alto nivel de muchas proteínas heterólogas en E. coli. Una manera de producir proteínas consiste en pasar por cuerpos de inclusión que se desarrollan en el citoplasma. Los componentes de las paredes celulares y membranas exteriores de las células procarióticas, que se usan para la producción (p. ej., E. coli), contaminan usualmente al material lisado celular que contiene la proteína heteróloga, cuando dichos cuerpos de inclusión se preparan por centrifugación a baja velocidad. El componente exterior de membrana se puede eliminar por extracción selectiva con detergentes y bajas concentraciones o bien de urea o de guanidina•HCl.

Un ejemplo de una de tales proteínas heterólogas es un derivado de tPA.

Un activador de plasminógeno tisular (tPA) es un polipéptido que contiene 527 residuos de aminoácidos (27) con una masa molecular de 72 kDa. La molécula está dividida en cinco dominios estructurales. De modo aproximado, la región terminal de N es un dominio de dedo (finger) cerrado en bucle, que es seguido por un dominio de factor de crecimiento. Dos dominios similares, Kringle 1 y Kringle 2, siguen a continuación. Los dominios de dedo y Kringle 2 se fijan específicamente a los coágulos de fibrina acelerando con ello la activación por la proteína tPA del plasminógeno fijado. Secuencia abajo del Kringle 2 está situada la proteasa de serina con su sitio catalítico situado en el extremo terminal de C. La proteasa de serina es responsable de convertir el plasminógeno en plasmina, una reacción que resulta importante en la homeostasis de la formación de fibrina y la disolución de coágulos. El correcto plegamiento del tPA requiere el correcto emparejamiento de 17 puentes de disulfuro en la molécula (1).

En el aspecto clínico, un tPA es un agente trombolítico selecto para el tratamiento de un infarto de miocardio agudo. Tiene la ventaja de no causar efectos colaterales en la formación de hemorragias sistémicas y el agotamiento de fibrinógeno (7). Células de melanoma de Bowes se usaron en primer término como una fuente en la producción de tPA para finalidades terapéuticas (12). Puesto que se requiere para uso clínico un proceso compatible con la producción eficiente de una proteína purificada en alto grado con buen rendimiento, la construcción de un tPA recombinante (r-tPA) de plena longitud progresó hasta llegar a células de mamíferos. Células de ovario de hámster chino (CHO) fueron transfectadas con el gen de tPA con el fin de sintetizar el r-tPA (8, 22). El producto recombinante, producido por un sistema de fermentación de material de mamíferos, se cosechaba a partir del medio de cultivo. Atraídos por la simplicidad y rentabilidad de la producción, se investigaron cierto número de esfuerzos en la producción de r-tPA a partir de bacterias, especialmente a partir de Escherichia coli (10, 13, 30). Observando el bajo rendimiento y la formación de cuerpos de inclusión, que daban como resultado un plegamiento defectuoso y una enzima inactiva, se han propuesto numerosas estrategias para solventar estos problemas. El criterio principal consiste en sintetizar la molécula más pequeña que es todavía activa en vez de un tPA de plena longitud.

Se consideraron varias variantes mutantes por deleción, inclusive la de Kringle 2 más proteasa de serina (K2S). Sin embargo, la actividad enzimática de la K2S recombinante (r-K2S) se obtuvo solamente cuando se consiguieron procesos de plegamiento renovado de cuerpos de inclusión purificados procedentes del compartimiento citoplásmico (16, 29). Con el fin de evitar los complicados procesos de plegamiento renovado y el suministro de proteínas periplásmicas, se explotaron sistemas especiales de expresión de bacterias (6, 31). A pesar de la expresión periplásmica del un tPA, la expresión excesiva condujo a agregados inactivos, incluso en la condición oxidante de grado relativamente alto en el periplasma.

En la técnica anterior, existen unas pocas descripciones de métodos para la preparación de una K2S recombinante en E. coli. Sin embargo, no existe ninguna descripción de un método que conduzca a un método barato para la producción a gran escala de una K2S biológicamente activa.

Obukowicz y colaboradores (25) expresaron y purificaron una r-K2S procedente del espacio periplásmico. La evidente desventaja de este método la constituía una operación suplementaria de extracción periplásmica, que no es apropiada para una producción a gran escala.

Saito y colaboradores (29) describen la expresión citoplásmica de una r-K2S. Los autores usaron unos procesos de renaturalización in vivo para la r-K2S expresada, que era purificada a partir del espacio citoplásmico de E. coli como cuerpo de inclusión. Boehringer Mannheim usa un similar y complicado proceso de desnaturalización y plegamiento renovado, que implica las operaciones de digestión de células, solubilización en condiciones desnaturalizantes y reductoras y reactivación en condiciones oxidantes en la presencia de GSH/GSSG, que no es rentable y requiere una mutación de la secuencia de aminoácidos (24).

En 1991, Waldenström y colaboradores (34) construyeron un vector (pEZZK2P) para la secreción del dominio de Kringle 2 más proteasa de serina a un material sobrenadante de cultivo de E. coli. Se usó hidroxilamina para eliminar el péptido de fusión ZZ desde la fracción purificada de IgG-Sepharose. El agente de disociación, hidroxilamina, requería una modificación de los sitios de disociación del Kringle 2 más proteasa de serina (Asn¹⁷⁷ rightarrow Ser y Asn¹⁸⁴ rightarrow Gln) para protegerlos de esta manera con respecto de la digestión por hidroxilamina. Sin embargo, la resultante molécula de K2S no nativa y no plegada apropiadamente, no es idónea para finalidades terapéuticas. La desacostumbrada secuencia puede incluso activar al sistema inmunitario humano. Hua y colaboradores (37) muestran la secreción de sw un polipéptido de fusión OmpA-K₂ en el periplasma de E. coli.

El problema que subyace en el presente invento fue por consiguiente proporcionar un método aplicable comercialmente para la producción a gran escala de K2S, en el que dicha proteína se segrega en su forma biológicamente activa dentro del material sobrenadante de cultivo.

Descripción del invento

Este problema se resolvió dentro del alcance de las reivindicaciones y de la memoria descriptiva del presente invento.

El uso del singular o plural en las reivindicaciones o en la memoria descriptiva no se pretende de ninguna manera que sea limitativo e incluye también la otra forma.

El invento se refiere a un método para la producción de K2S derivada de un ADN recombinante en células procarióticas, en el que dicha proteína heteróloga se segrega extracelularmente como una proteína activa y correctamente plegada, cuyo método está caracterizado porque la célula procariótica contiene y expresa un vector que comprende el ADN que codifica dicha proteína heteróloga en unión operativa con el ADN que codifica el péptido de señal OmpA.

Sorprendentemente, el uso del péptido de señal OmpA, en combinación con los aminoácidos terminales de N, SEGNSD (SEQ ID NO: 3), traslada (transloca) a las proteínas que se derivan de un ADN recombinante, hacia la superficie exterior y facilita la liberación de la molécula funcional y activa dentro del medio de cultivo, en un grado mayor que...

1. Método para la producción de un dominio kringle 2 más proteasa de serina (K2S), activo y correctamente plegado, del activador de plasminógeno tisular o una variante funcional de éste en el sobrenadante de células procarióticas, caracterizado porque la célula procariótica contiene y expresa un vector que comprende un ADN que codifica el péptido señal de la proteína de la membrana externa A (OmpA), que está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica un péptido corto, caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEGNSD (SEQ ID NO:3), que por sí misma está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica el dominio kringle 2 más proteasa de serina del activador de plasminógeno tisular humano o un derivado funcional de éste.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula procariótica es E. coli.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes operaciones:

a) el ADN que codifica el dominio kringle 2 más proteasa de serina se amplifica por una PCR;

b) el producto de la PCR se purifica;

c) dicho producto de PCR se introduce en un vector que comprende el ADN que codifica el péptido de señal OmpA y el ADN que codifica la gpIII de una manera tal que dicho producto de PCR está unido operativamente secuencia arriba con el ADN que codifica la secuencia de señal OmpA y está unido secuencia abajo con el ADN que codifica la gpIII de dicho vector;

d) se introduce un codón de detención entre dicho dominio kringle 2 más proteasa de serina y la gpIII;

e) dicho vector se expresa por la célula procariótica;

f) la proteína dominio kringle 2 más proteasa de serina se purifica.

4. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el vector es un vector fagémido que comprende el ADN que codifica el péptido de señal OmpA y el ADN que codifica la gpIII.

5. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el vector es el fagémido pComb3HSS.

6. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia de ADN del OmpA comprende la siguiente secuencia:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC (SEQ ID NO:1).

7. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ADN que codifica el péptido señal de la proteína de la membrana externa A (OmpA), que por sí misma está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica un péptido corto caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEGNSD (SEQ ID NO:3), que por sí misma está fusionada secuencia abajo a un ADN que codifica el dominio kringle 2 más proteasa de serina del activador de plasminógeno tisular humano o una variante funcional de éste, está precedido por un promotor lac y/o por un sitio de fijación a ribosomas.