Célula huésped procariótica transformada, que contiene:

i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular,

operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante de ARNII o una parte del mismo, y

ii) un plásmido que comprende un origen de replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNI o una parte del mismo,

en la que la unión de la secuencia antisentido codificada por ARNI a ARNm transcrito a partir de ARNII inhibe la acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el crecimiento celular

Mantenimiento de plásmido.

Campo de la invención

La invención se refiere a un sistema para el mantenimiento estable de un plásmido, a células huésped para la utilización en dicho sistema y a métodos de utilización del sistema para obtener un plásmido que resulta útil en aplicaciones médicas.

Antecedentes de la invención

Se utilizan rutinariamente plásmidos en la preparación de proteínas recombinantes y en la preparación de ADN con fines de terapia génica. El mantenimiento estable de un plásmido en una célula huésped resulta importante para la preparación eficiente de estos productos. Sin embargo, el ADN extracromosómico alojado en células huésped es inherentemente inestable debido a la carga metabólica incrementada para las células que contienen el plásmido en comparación con células que se encuentran libres de plásmido. Para mantener la estabilidad del plásmido y reducir la carga metabólica, se han manipulado los plásmidos para que contengan marcadores seleccionables dominantes.

El método convencional de mantenimiento de plásmidos en células en cultivo es incluir un gen de resistencia a antibiótico en el plásmido y cultivar las células en presencia del antibiótico apropiado. Para las células o plásmidos destinados al uso terapéutico, lo anterior presenta la desventaja de que la utilización de un plásmido que contenga el gen de resistencia a antibiótico puede construir a la extensión de resistencias a antibióticos.

Se han intentado algunos métodos de mantenimiento de plásmido para explotar los mecanismos naturales de eliminación posteriores a la segregación controlados por genes del plásmido. Por ejemplo, los sistemas hok/sok, srnB y pnd implican una proteína asesina codificada por un ARNm estable y regulado por un ARN antisentido inestable pequeño que se une al ARN asesino y lo inactiva. El ARN asesino resulta retenido en segregantes sin plásmido tras degradarse el ARN y se traduce en la proteína letal. Se investigó el mantenimiento de plásmido utilizando el sistema hok/sok en la cepa de vacuna de vector vivo Salmonella typhi CDV 908 htr-A (Galen et al., Infect. Immunol. 67:6424-6433, 1999). Sin embargo, dichos mecanismos de eliminación posteriores a la segregación no permiten la selección de plásmidos tras la transformación y por lo tanto todavía dependen de la presencia de un gen de resistencia a un antibiótico en el plásmido.

Se han desarrollado algunos métodos alternativos de mantenimiento y selección de plásmidos sin selección con antibióticos, en los que el plásmido codifica un gen que complementa una auxotrofia de la célula huésped. Por ejemplo, una célula huésped puede ser una célula mutante que es capaz de sintetizar un metabolito aminoácido esencial y que únicamente puede sobrevivir en medio que no incluye el aminoácido en presencia de un plásmido que comprenda un gen codificante del elemento que falta para la síntesis de dicho aminoácido (Wang M-D et al., J. Bacteriol. 169:5610-5614, 1987). Sin embargo, este enfoque limita la composición del medio de cultivo, debido a que debe omitirse el aminoácido. Un método alternativo, que puede utilizarse en medios complejos, utiliza una célula huésped mutante con un gen de ARNt sintetasa termosensible que únicamente puede sobrevivir a temperaturas no permisivas en el caso de que un plásmido que comprenda el gen de la ARNt sintetasa de tipo salvaje se encuentre presente (Skogman et al., Gene 31:117-122, 1984). Otro método de selección utiliza un gen de ARNt transportado por el plásmido para complementar mutaciones sin sentido en genes cromosómicos esenciales en una célula huésped mutante (Zengel et al., J. Bacteriol. 145:459-465, 1981). Alternativamente, puede introducirse en el cromosoma huésped un gen que incrementa la carga metabólica de la célula, tal como el operón pil, de manera que la célula huésped únicamente sobreviva en presencia de un plásmido codificante de la proteína represora correspondiente (Ogden et al., Biotech. Bioeng. 40:1027-1038, 1992).

La patente EP nº 0851932 describe un método de mantenimiento dentro de células huésped en cultivo in vitro por medio de la titulación de represor de operador. El método implica manipular una célula huésped de manera que contenga un primer gen cromosómico codificante de un represor y un segundo gen cromosómico esencial para el crecimiento de la célula que presenta una secuencia de operador para el represor en su región de control. En ausencia de un plásmido, la expresión del segundo gen cromosómico resulta inhibida por la unión del represor al operador y la célula muere. Los plásmidos para el mantenimiento en esta célula huésped se manipulan para contener la secuencia de operador, de manera que, en presencia del plásmido, se reduce el título del represor respecto al operador para el gen que resulta esencial para el crecimiento celular, por lo que el gen se expresa y la célula sobrevive. Este mecanismo también se describe en Williams et al. (Nucleic Acids Research 26(9):2120-2124, 1999), y en Cranenburgh et al. (Nucleic Acid Research 29(5):e26-e27, 2001).

Aunque se conocen algunos mecanismos de mantenimiento y selección de plásmidos que no se basan en la selección con antibióticos, sigue existiendo una necesidad de desarrollar métodos adicionales en vista de la creciente importancia de los plásmidos para la producción de ADN y de proteínas recombinantes para aplicaciones terapéuticas. Además, los sistemas de mantenimiento y selección de plásmidos desarrollados hasta hoy requieren la utilización de plásmidos que han sido especialmente modificados para la utilización en estos sistemas. Sigue existiendo una necesidad de un sistema de mantenimiento y selección de plásmidos que no implique la utilización de resistencias a antibióticos y que utilice plásmidos que sean comunes de la técnica y que no requieran ninguna modificación especial.

D1 da a conocer una célula bacteriana que presenta un gen cromosómico productor de una sustancia tóxica (incluyendo el producto del gen hok) y un plásmido codificante de una sustancia que neutraliza la acción del gen cromosómico, incluyendo el antisentido codificante por el gen sok. Asimismo, D1 da a conocer un método de mantenimiento de un plásmido en dicha célula en cultivo, composiciones farmacéuticas que comprenden dicha célula huésped y métodos para administrar dichas composiciones en un paciente para la inmunización o para la teoría.

D2 es una revisión de ARNs antisentido en plásmidos, haciendo referencia a mecanismos de eliminación posteriores a la segregación, incluyendo hok/sok, par, ARNI y ARNII.

D3 da a conocer plásmidos que comprenden un sistema de mantenimiento de plásmidos basado en un sistema de eliminación posterior a la segregación (por ejemplo sok/hok, ARNI/ARNII y par).

D4 da a conocer un sistema para la estabilización de un plásmido que utiliza el sistema de titulación del represor; D4 da a conocer la utilización de los genes DapD y LacI en este sistema.

Descripción resumida de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped procariótica transformada que contiene:

i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular, operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante de ARNII o una parte del mismo, e

ii) un plásmido que comprende un origen de replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNI o una parte del mismo,

en el que la unión de la secuencia antisentido codificada por ARNI a ARNm transcrito a partir de ARNII inhibe la acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el crecimiento celular.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped procariótica transformada que contiene:

i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular, operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante de ARNI o una parte del mismo, e

ii) un plásmido que comprende un origen de replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNII o una parte del mismo,

en el que la unión de la secuencia antisentido codificada por ARNII a ARNm transcrito a partir de ARNI inhibe la acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el crecimiento celular.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia antisentido" se refiere a una secuencia de ácidos...

1. Célula huésped procariótica transformada, que contiene:

i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular, operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante de ARNII o una parte del mismo, y

ii) un plásmido que comprende un origen de replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNI o una parte del mismo,

en la que la unión de la secuencia antisentido codificada por ARNI a ARNm transcrito a partir de ARNII inhibe la acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el crecimiento celular.

2. Célula huésped procariótica transformada, que contiene:

i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante de ARNI o una parte del mismo, y

ii) un plásmido que comprende un origen de replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNII o una parte del mismo,

en la que la unión de la secuencia antisentido codificada por ARNII a ARNm transcrito a partir de ARNI inhibe la acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el crecimiento celular.

3. Célula huésped procariótica transformada según la reivindicación 1 ó 2, en la que el plásmido comprende un sitio de clonación para la inserción de un gen de interés.

4. Célula huésped procariótica transformada según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que el plásmido comprende además un gen de interés.

5. Célula huésped procariótica que comprende un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular operablemente ligado a una secuencia reguladora situada cadena arriba del gen cromosómico, en la que la secuencia reguladora es un gen de ARNI o una parte del mismo, o un gen de ARNII o una parte del mismo.

6. Célula huésped procariótica transformada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una célula huésped procariótica según la reivindicación 5, en la que la célula se encuentra en cultivo in vitro.

7. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según la reivindicación 6 que es una célula bacteriana.

8. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según la reivindicación 7, en la que la célula es una célula bacteriana Gram-negativa.

9. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según la reivindicación 8, en la que la célula es una célula de E. coli o una célula de Salmonella.

10. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según la reivindicación 7, en la que la célula es una célula bacteriana Gram-positiva.

11. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según la reivindicación 10, en la que la célula es una célula de Bacillus.

12. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, que es una célula atenuada.

13. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el gen cromosómico es un gen de una toxina.

14. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según la reivindicación 13, en la que el gen de toxina es sacB.

15. Célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el gen cromosómico codifica una proteína represora que inhibe la expresión de un segundo gen cromosómico que resulta esencial para el crecimiento celular.

16. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según la reivindicación 15, en la que el segundo gen cromosómico es condicionalmente esencial para el crecimiento celular.

17. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según la reivindicación 15 ó 16, en la que el gen cromosómico codifica el represor de lacI y el segundo gen cromosómico se encuentra operablemente ligado a un operador y promotor lac.

18. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según la reivindicación 15 ó 16, en la que el gen cromosómico es dapD o fabA.

19. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el gen cromosómico codifica una secuencia antisentido que inhibe la expresión de un segundo gen cromosómico esencial para el crecimiento celular.

20. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según la reivindicación 19, en la que la secuencia antisentido codificada por el gen cromosómico inhibe la expresión del segundo gen cromosómico mediante la unión al gen cromosómico.

21. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según la reivindicación 19, en la que la secuencia antisentido codificada por el gen cromosómico inhibe la expresión del segundo gen cromosómico mediante la unión a ARNm transcrito a partir del segundo gen cromosómico.

22. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el segundo gen cromosómico es condicionalmente esencial para el crecimiento celular.

23. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el segundo gen cromosómico es dapD o fabA.

24. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que el gen cromosómico o la fusión de secuencia reguladora-gen cromosómico se encuentra bajo el control de un promotor constitutivo.

25. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que el gen cromosómico o la fusión de secuencia reguladora-gen cromosómico se encuentra bajo el control de un promotor inducible.

26. Método de mantenimiento de un plásmido en una célula huésped in vitro, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 25 bajo condiciones suficientes para permitir que dicha célula crezca.

27. Método para producir ADN de plásmido, que comprende cultivar una célula huésped procariótica transformada según el método según la reivindicación 26 y asilar el ADN de plásmido.

28. Método para producir una proteína recombinante, que comprende cultivar una célula huésped procariótica transformada, que comprende un plásmido codificante de una proteína de interés según el método según la reivindicación 26, y asilar la proteína a partir de la célula.

29. Composición farmacéutica que comprende una célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 conjuntamente con un excipiente, diluyente o tampón farmacéuticamente aceptable.

30. Célula huésped procariótica transformada o célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la utilización en terapia.

31. Utilización de una célula huésped procariótica transformada o una célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 en la preparación de un medicamento para la administración de genes o proteínas.