La presente invención se relaciona con el desarrollo de unos vectores y cepas como sistemas de expresión que ofrecen la posibilidad de identificar genes de interés que no se expresan por ellos mismos en las bacterias que albergan la biblioteca metagenómica,

permitiendo así la detección de las funciones que codifican, que de lo contrario permanecerían silenciadas y sin detectar.

SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGA PARA EL ANÁLISIS FUNCIONAL DE BIBLIOTECAS METAGENÓMICAS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención va dirigida al aislamiento de genes que codifican para funciones o actividades de interés. La invención se refiere a las áreas de la genética microbiana y la tecnología de ADN recombinante. Más específicamente, la invención se refiere a la combinación de elementos de diferentes circuitos reguladores de fagos y bacterias para construir vectores y cepas especializadas para su uso en el análisis funcional de bibliotecas metagenómicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La metagenómica funcional o análisis metagenómico dirigido a la función ofrece la posibilidad de descubrir nuevas proteínas con funciones conocidas, nuevas proteínas con funciones novedosas, proteínas conocidas con funciones únicas y productos naturales novedosos que tienen actividades útiles en la medicina, agricultura o industria. Sin embargo, también es un reto encontrar la célula huésped que incluya todos los genes requeridos para expresar la función de interés y que exprese dicha función. El análisis según la función comienza con un examen amplio para identificar clones que expresan un rasgo deseado, seguido por la caracterización de los clones activos mediante análisis de secuencias y bioquímico. El éxito requiere la expresión fiel del gen o genes de interés y la secreción del producto génico, si el examen o ensayo requiere que sea extracelular.

La limitación significativa es que muchos genes, quizá la mayoría, no se expresarán en cualquier bacteria huésped particular seleccionada para la clonación. De hecho, existe una contradicción inherente en este enfoque ya que los genes se clonan a partir de organismos exóticos desconocidos para descubrir nuevos motivos en biología y sin embargo se requiere que estos genes se expresen en Escherichia coli u otra bacteria domesticada con el fin de que se detecten.

Es esencial desarrollar sistemas de expresión de genes heterólogos en las bacterias que albergan la biblioteca metagenómica con el fin de maximizar las posibilidades de expresar cualquier gen presente en la biblioteca metagenómica. Esto ampliará claramente el potencial de la metagenómica funcional.

La gran mayoría de los microorganismos en entornos naturales no pueden cultivarse. Por tanto, una enorme fuente de información genética sigue sin descubrirse incluso tras un examen extensivo basado en métodos de cultivo convencionales. Para explorar estas fuentes, se han desarrollado enfoques novedosos que implican el aislamiento y la clonación directos de ADN de muestras del entorno en vectores adecuados, creando así bibliotecas metagenómicas complejas.

Las bibliotecas metagenómicas pueden analizarse para determinar rutas y genes novedosos con técnicas basadas en secuencias o mediante análisis, que implican el examen de la actividad, de la expresión de rasgos fenotípicos novedosos en huéspedes sustitutos. La ventaja de tales enfoques de examen funcional es que pueden detectar actividades que se originan a partir de genes cuyas funciones no pueden predecirse mediante análisis bioinformáticos de secuencias de ADN o proteicas. Por otro lado, la identificación de actividades novedosas mediante examen funcional depende de la expresión satisfactoria de los genes clonados. La limitación significativa es que muchos genes, quizá la mayoría, no se expresarán en cualquier bacteria huésped particular seleccionada para la clonación. Incluso aunque se han expresado actividades novedosas usando E. coli como huésped, existe una ventaja potencial obvia de aumentar las posibilidades de expresión génica metagenómica en los huéspedes bacterianos para detectar capacidades de expresión adicionales.

Un enfoque para aumentar las posibilidades de expresión génica metagenómica consiste en clonar fragmentos de ADN metagenómico cortos de unas pocas kilobases de longitud en vectores de expresión que contienen un promotor cerca del sitio de clonación y cuya transcripción puede discurrir por el ADN metagenómico. Por tanto, la expresión génica se basa en la transcripción génica a partir del promotor de vector heterólogo. El principal inconveniente es que el ADN que va a expresarse no debe portar un terminador de la transcripción entre el promotor del vector y el gen de interés. Por tanto, las posibilidades de expresión génica metagenómica se correlacionan inversamente con el tamaño del ADN clonado. La reducción del tamaño de los fragmentos de ADN clonado en las bibliotecas metagenómicas implica que la probabilidad de tener un gen de interés en un clon se reduce también y, por tanto, se requieren un mayor número de clones metagenómicos para cubrir la misma longitud de ADN metagenómico total. Este enfoque ha sido satisfactorio para identificar actividades que pueden seleccionarse y dependen de la expresión de un único gen (Sommer et al., 2009 Science 28, 325 (5944) :1128-31) pero no parece ser adecuado para actividades que no pueden seleccionarse ya que requiere la obtención y el examen de un mayor número de clones metagenómicos. La limitación es incluso mayor cuando la actividad de interés requiere la expresión de más de un gen.

Los vectores más comunes usados para construir bibliotecas metagenómicas se basan en el factor sexual F de E. coli, que pueden mantener de manera estable grandes fragmentos de ADN. Estos vectores pueden ser vectores de tipo fósmido, que pueden estar empaquetados en cabezas de fagos lambda, o BAC (cromosomas artificiales bacterianos) que albergan y mantienen fragmentos de ADN incluso mayores. La expresión de genes metagenómicos en esta clase de bibliotecas se basa en su propia capacidad de expresión en el huésped bacteriano.

El vector pCC1FOS es uno de los vectores tipo fósmido más común, usado para construir bibliotecas metagenómicas (casi 300 publicaciones usaron este vector en los últimos 5 años) . Puede albergar aproximadamente 40 kb de ADN de inserto, que se empaquetan eficazmente en partículas lambda. Además del replicón F, el vector alberga un replicón adicional que proporciona un mayor número de copias que puede activarse haciendo crecer las bacterias con arabinosa. Esto es muy conveniente para amplificar la función o actividad de interés, lo que facilita su detección si el gen codificante se expresa en E. coli. Se han construido con diferentes grados de éxito varios vectores basados en F para permitir la transferencia y el mantenimiento de la biblioteca metagenómica entre diferentes bacterias huésped en un intento por aumentar las posibilidades de expresar un gen metagenómico en diferentes antecedentes bacterianos (Sosio et al., 2000 Nature Biotechnol 18: 343-345; Martinez et al., 2004 Appl. Environ. Microb. 70: 2452-2463 ; Hain et al., 2008 Microb. 74: 1892-1901 ; Aakvik et al, 2009 FEMS Microbiol Lett 296: 149-158) . Sin embargo, la expresión de los genes metagenómicos todavía se basa en su propia capacidad de expresión en el huésped bacteriano.

Es esencial, por tanto, desarrollar nuevas herramientas biológicas basadas en la expresión génica heteróloga para aprovechar la metagenómica funcional potencial.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los inventores han desarrollado unos sistemas de expresión que, sorprendentemente, ofrecen la posibilidad de identificar genes de interés que no se expresan por ellos mismos en las bacterias que albergan la biblioteca metagenómica, permitiendo así la detección de las funciones que codifican, que de lo contrario permanecerían silenciadas y sin detectar. Esto da como resultado un mayor número de clones metagenómicos que presentan una función de interés particular para una biblioteca metagenómica dada.

Una ventaja adicional, proporcionada por el gfp carente de promotor en el vector, es que los sistemas reguladores desconocidos que responden a cualquier señal que puede actuar en las células de la invención pueden identificarse usando la tecnología SIGEX (Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:88-93) .

Por tanto la presente invención facilita la expresión génica metagenómica permitiendo la identificación de las funciones de los genes por un lado y el uso adicional de un gen indicador que permite detectar sistemas reguladores metagenómicos que pueden actuar en la cepa huésped.

En un primer aspecto la invención se relaciona con el vector 1 para el clonaje de ADN en una célula hospedadora, en donde dicho vector de clonaje es un vector artificial que se replica autónomamente en el interior de dicha célula hospedadora, que comprende:... [Seguir leyendo]

1. Un vector para el clonaje de ADN en una célula hospedadora , en donde dicho vector de clonaje es un vector artificial que se replica autónomamente en el interior de dicha célula hospedadora, que comprende:

(a) un origen de transferencia de ADN,

(b) un promotor T7, y

(c) un sitio de clonación de ADN metagenómico.

2. Un vector para el clonaje de ADN en una célula hospedadora, en donde dicho vector de clonaje es un vector artificial que se replica autónomamente en el interior de dicha célula hospedadora, que comprende:

(a) un origen de transferencia de ADN,

(b) un promotor regulable psal,

(c) una secuencia que codifica para el sitio nutL, y

(d) un sitio de clonación de ADN metagenómico.

3. Un vector para el clonaje de ADN en una célula hospedadora, en donde dicho vector de clonaje es un vector artificial que se replica autónomamente en el interior de dicha célula hospedadora, que comprende:

(a) un origen de transferencia de ADN,

(b) un promotor regulable psal,

(c) una secuencia que codifica para el sitio nutL,

(d) un promotor T7, y

(e) un sitio de clonación de ADN metagenómico.

4. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una secuencia de ADN metagénomico en el sitio de clonación de ADN metagenómico operativamente unido.

5. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el origen de transferencia de ADN es el oriT del plásmido RP4.

6. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende un gen reportero.

7. Vector según la reivindicación 6, en donde dicho gen reportero es el gen de gfp.

8. Método para la expresión heteróloga de bibliotecas metagenómicas y analizar la

ES 2 383 078 Al

función de genes que comprende el uso de un vectores según cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 7.

9. Método de clonaje de ADN que comprende:

(a) introducir el ADN en uno de los vectores según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, (b) introducir dicho vector de clonaje en una célula hospedadora inicial, preferiblemente en una bacteria,

(c) cultivar dicha célula hospedadora, y

(d) transferir dicho ADN clonado a una o más células huéspedes secundarias.

10. Método para preparar una biblioteca de clones de ADN que comprende:

(a) introducir dicho ADN en uno de los vectores según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

(b) introducir dicho vector en una primera célula hospedadora,

(c) cultivar dicha célula hospedadora para preparar la primera biblioteca de clones 20 de ADN, y (d) transferir dicha primera biblioteca a una o más células huéspedes secundarias para preparar una o más bibliotecas secundarias.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA 4

FIGURA 5

FIGURA 6

Lista de secuencias

<220>

<223> Cebador psalnut1

<400> 3 taaggcgcct tattgctggt gcccggccgg gcgcaatatt catgttgatg atttattata 60

tatcgagtgg tgtatttatc aatattgttt gctcc 95

<210> 4

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador psalnut2

<400> 4 gtcaccttca tggtggtcag tgcgtcctgc tgattaataa cgataacgga gcaaacaata 60

ttgataaata cacc 74

<210> 5

<211> 85

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador psalnut3

<400> 5 gcactgacca ccatgaaggt gacgctctta aaaattaagc cctgaagaag ggcagcattc 60

aaagcagaag gctttggggt gtgtg 85

<210> 6

<211> 68

<212> DNA

aggtcttcta gattatttgt atagttcatc

gaagaggcac

<400> 18

tatagagctc tgtaggctgg agctgcttc

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador thnB-6-thnC

<400> 22 gatcatgcat 10

<210> 23

<211> 314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Secuencia oriT de RP4

<400> 23 cttgccctca tctgttacgc cggcggtagc cggccagcct cgcagagcag gattcccgtt 60

gagcaccgcc aggtgcgaat aagggacagt gaagaaggaa cacccgctcg cgggtgggcc 120

tacttcacct atcctgcccg gctgacgccg ttggatacac caaggaaagt ctacacgaac 180

cctttggcaa aatcctgtat atcgtgcgaa aaaggatgga tataccgaaa aaatcgctat 240

aatgaccccg aagcagggtt atgcagcgga aaagcgctgc ttccctgctg ttttgtggaa 300

tatctaccga ctgg 314

<210> 24

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> promotor psal (incluyendo sitio de reconocimiento del activador NahR)

cccgaaggtt atgtacagga aagaactata tttttcaaag atgacgggaa ctacaagacg 360 cgtgctgaag tcaagtttga aggtgatacc cttgttaata gaatcgagtt aaaaggtatt 420 gattttaaag aagatggaaa cattcttgga cacaaattgg aatacaacta taactcacac 480 aatgtataca tcatggcaga caaacaaaag aatggaatca aagttaactt caaaattaga 540 cacaacattg aagatggaag cgttcaacta gcagaccatt atcaacaaaa tactccaatt 600 ggcgatggcc ctgtcctttt accagacaac cattacctgt ccacacaatc tgccctttcg 660 aaagatccca acgaaaagag agaccacatg gtccttcttg agtttgtaac agctgctggg 720 attacacatg gcatggatga actatacaaa taa 753

<210> 27

<211> 717

<212> DNA

<213> Aequorea victoria <400> 27 atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180 gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240 catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300 aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360 aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420 ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480 atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

<210> 28

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Fragmento con nuevo sitio Eco72I flanqueado por dianas CeuI

<400> 28 cggtaactat aacggtccta aggtagcgaa tgaatggcac gtggcatcga taactataac 60

ggtcctaagg tagcgagc 78

<210> 29

<211> 95

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> placUV5

<400> 29 ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat aatgtgtgga 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacag 95

<210> 30

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> nasF

<400> 30 gagtgaataa aaggttttgg gcagcgcgcc aatggcggcg cgtatgtcca gggataaagg 60

cgtccagcgg tgcgtaagca ccgccgggcg cttttttttt gcgc 104

<210> 31

<211> 2693

<212> DNA

<213> T7 phage <400> 31 ttactaactg gaagaggcac taaatgaaca cgattaacat cgctaagaac gacttctctg 60 acatcgaact ggctgctatc ccgttcaaca ctctggctga ccattacggt gagcgtttag 120 ctcgcgaaca gttggccctt gagcatgagt cttacgagat gggtgaagca cgcttccgca 180 agatgtttga gcgtcaactt aaagctggtg aggttgcgga taacgctgcc gccaagcctc 240 tcatcactac cctactccct aagatgattg cacgcatcaa cgactggttt gaggaagtga 300 aagctaagcg cggcaagcgc ccgacagcct tccagttcct gcaagaaatc aagccggaag 360 ccgtagcgta catcaccatt aagaccactc tggcttgcct aaccagtgct gacaatacaa 420 ccgttcaggc tgtagcaagc gcaatcggtc gggccattga ggacgaggct cgcttcggtc 480 gtatccgtga ccttgaagct aagcacttca agaaaaacgt tgaggaacaa ctcaacaagc 540 gcgtagggca cgtctacaag aaagcattta tgcaagttgt cgaggctgac atgctctcta 600 agggtctact cggtggcgag gcgtggtctt cgtggcataa ggaagactct attcatgtag 660 gagtacgctg catcgagatg ctcattgagt caaccggaat ggttagctta caccgccaaa 720 atgctggcgt agtaggtcaa gactctgaga ctatcgaact cgcacctgaa tacgctgagg 780

ctatcgcaac ccgtgcaggt gcgctggctg gcatctctcc gatgttccaa ccttgcgtag

ttcctcctaa gccgtggact ggcattactg gtggtggcta ttgggctaac ggtcgtcgtc 900 ctctggcgct ggtgcgtact cacagtaaga aagcactgat gcgctacgaa gacgtttaca 960 tgcctgaggt gtacaaagcg attaacattg cgcaaaacac cgcatggaaa atcaacaaga 1020 aagtcctagc ggtcgccaac gtaatcacca agtggaagca ttgtccggtc gaggacatcc 1080 ctgcgattga gcgtgaagaa ctcccgatga aaccggaaga catcgacatg aatcctgagg 1140 ctctcaccgc gtggaaacgt gctgccgctg ctgtgtaccg caaggacaag gctcgcaagt 1200 ctcgccgtat cagccttgag ttcatgcttg agcaagccaa taagtttgct aaccataagg 1260 ccatctggtt cccttacaac atggactggc gcggtcgtgt ttacgctgtg tcaatgttca 1320 acccgcaagg taacgatatg accaaaggac tgcttacgct ggcgaaaggt aaaccaatcg 1380 gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgcgggt gtcgataagg 1440 ttccgttccc tgagcgcatc aagttcattg aggaaaacca cgagaacatc atggcttgcg 1500 ctaagtctcc actggagaac acttggtggg ctgagcaaga ttctccgttc tgcttccttg 1560 cgttctgctt tgagtacgct ggggtacagc accacggcct gagctataac tgctcccttc 1620 cgctggcgtt tgacgggtct tgctctggca tccagcactt ctccgcgatg ctccgagatg 1680 aggtaggtgg tcgcgcggtt aacttgcttc ctagtgaaac cgttcaggac atctacggga 1740 ttgttgctaa gaaagtcaac gagattctac aagcagacgc aatcaatggg accgataacg 1800 aagtagttac cgtgaccgat gagaacactg gtgaaatctc tgagaaagtc aagctgggca 1860 ctaaggcact ggctggtcaa tggctggctt acggtgttac tcgcagtgtg actaagcgtt 1920 cagtcatgac gctggcttac gggtccaaag agttcggctt ccgtcaacaa gtgctggaag 1980 ataccattca gccagctatt gattccggca agggtctgat gttcactcag ccgaatcagg 2040 ctgctggata catggctaag ctgatttggg aatctgtgag cgtgacggtg gtagctgcgg 2100 ttgaagcaat gaactggctt aagtctgctg ctaagctgct ggctgctgag gtcaaagata 2160 agaagactgg agagattctt cgcaagcgtt gcgctgtgca ttgggtaact cctgatggtt 2220 tccctgtgtg gcaggaatac aagaagccta ttcagacgcg cttgaacctg atgttcctcg 2280 gtcagttccg cttacagcct accattaaca ccaacaaaga tagcgagatt gatgcacaca 2340 aacaggagtc tggtatcgct cctaactttg tacacagcca agacggtagc caccttcgta 2400 agactgtagt gtgggcacac gagaagtacg gaatcgaatc ttttgcactg attcacgact 2460 ccttcggtac cattccggct gacgctgcga acctgttcaa agcagtgcgc gaaactatgg 2520 ttgacacata tgagtcttgt gatgtactgg ctgatttcta cgaccagttc gctgaccagt 2580 tgcacgagtc tcaattggac aaaatgccag cacttccggc taaaggtaac ttgaacctcc 2640 gtgacatctt agagtcggac ttcgcgttcg cgtaacgcca aatcaatacg act 2693

<210> 32

<211> 903

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> nahR

<400> 32 tcaatccgta aacaggtcaa acatcagttg ccgcaaccaa atattggcta ggtccttgtg 60 gtacttcgca tgccagaaca tgttgatggc tatttcaggc aagacgactg ggtgcggcaa 120 ggcgcttagg ccgaagggct ccacgcagca gtcggctaaa cgtatcggca cagtggcgag 180 cagatcggtg cgctggagga tgtggccaac ggcggcgaag tgcggcactt ccagacggat 240 gtcgcgccgg atgccgaccc gtgtcatgta cgtgtccacc tcgccgtggc cggtgccagc 300

ggcgatgaca cgcacgtggc cgtaggaaca gaagcgctcc agagtcaggg gttcgcgggt 360 gactggatgg tccttgcgac ataggcacac gtagtgattc tggagcagcc ggcgctgaaa 420 gaagccagtt tgcagattgg gaagcaggcc cacggccaag tccacggttc cgttctgcaa 480 ggcctgcatc aggctcatcg aactgtcgcg caccgtactg atcacgcaat tgggggcctg 540 gtgagccagc acatccatca gccgcggcat gaagtagatc tcgccaatgt cggtcatggc 600 cagggtgaag gtacgctcgc tggtcagcgg atcgaagctt tcatggtgct gtagggcgtt 660 gcgcagtgcg tgcatggccg aagtgacggg ctcggccaga tgcgcggcat agggtgtggg 720 ttccattccc tgatgtgtgc gcacgaagag tgggtcctgt agcgaggtgc gcaggcgttt 780 cagcgcattg ctcacggcag gctgggtcag gcccaggttc tccgcagtga tagagacgcg 840 tctgtcgacc agcaactggt tgaacaccac cagcaggttt aaatccaggt cacgcagttc 900 cat 903

<210> 33

<211> 154

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> pnah-psal <400> 33 ggggcctcgc ttgggttatt gctggtgccc ggccgggcgc aatattcatg ttgatgattt 60 attatatatc gagtggtgta tttatcaata ttgtttgctc cgttatcgtt attaacaagt 120 catcaataaa gccatctgca ggcatgcaag cttc 154

<210> 34 <211> 594

<212> DNA

<213> Lambda phage <400> 34 ccactggcgg tgatactgag cacatcagca ggacgcactg accaccatga aggtgacgct 60 cttaaaaatt aagccctgaa gaagggcagc attcaaagca gaaggctttg gggtgtgtga 120 tacgaaacga agcattggcc gtaagtgcga ttccggatta gctgccaatg tgccaatcgc 180 ggggggtttt cgttcaggac tacaactgcc acacaccacc aaagctaact gacaggagaa 240 tccagatgga tgcacaaaca cgccgccgcg aacgtcgcgc agagaaacag gctcaatgga 300 aagcagcaaa tcccctgttg gttggggtaa gcgcaaaacc agttaaccgc cctattctct 360 cgctgaatcg caaaccgaaa tcacgagtag aaagcgcact aaatccgata gaccttacag 420 tgctggctga ataccacaaa cagattgaaa gcaacctgca acgtattgag cgcaagaatc 480 agcgcacatg gtacagcaag cctggcgaac gcggcataac atgcagtgga cgccagaaaa 540 ttaagggaaa atcgattcct cttatctagt tacttagata ttggccttgg cttt 594

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Lambda phage <400> 35 taatacgact cactataggg 20