Métodos para construir vacunas sin resistencia antibiótica.

Un método de diseño de una cepa vacunal recombinante de Listeria para expresar un antígeno heterólogo,

comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una cepa de Listeria auxótrofa para la síntesis de D-alanina que comprende una mutación en un gen D-alanina racemasa y en un gen D-aminoácido transferasa en dicho cromosoma de Listeria con un plásmido, comprendiendo dicho plásmido:

una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un antígeno heterólogo, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una D-alanina racemasa,

en el que dicho plásmido no confiere resistencia antibiótica a dicha cepa vacunal auxótrofa de Listeria,

en el que dicha cepa auxótrofa de Listeria absorbe dicho plásmido,

en el que dicha D-alanina racemasa complementa dicha mutación en dicho gen D-alanina racemasa de dicha cepa bacteriana de Listeria,

en el que dicha cepa auxótrofa de Listeria crecerá en ausencia de D-alanina,

en el que dicho plásmido comprende un gen prfA, y

en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico se une operativamente a un promotor procariota, diseñando así una cepa vacunal recombinante de Listeria para expresar un antígeno heterólogo.

Métodos para construir vacunas sin resistencia antibiótica.

Se proporcionan cepas vacunales de Listeria que expresan un antígeno heterólogo y una enzima metabólica, y 5 métodos para generar las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las vacunas representan la medida de salud pública más rentable y beneficiosa conocida actualmente. Sin 10 embargo, a medida que crece la comprensión de las enfermedades infecciosas y neoplasias, se ha hecho evidente que las estrategias vacunales tradicionales pueden no ser completamente eficaces. Las vacunas tradicionales han empleado organismos muertos o atenuados o subunidades de antígeno para provocar inmunidad en un animal. Un límite con estos enfoques, especialmente con vacunas muertas o subunidades, es que la respuesta inmune es principalmente humoral en la naturaleza y, por lo tanto, no es eficaz en la lucha contra el organismo intracelular o 15 tumores que requieren inmunidad mediada por células para su destrucción. De forma análoga, las bacterias atenuadas o inactivadas a menudo solamente inducen inmunización durante un período corto de tiempo y la inmunidad se limita a una respuesta humoral. Adicionalmente, las vacunas bacterianas atenuadas o inactivadas tradicionales no provocan la respuesta inmune a los linfocitos T citotóxicos (CTL) necesaria para la lisis de las células tumorales y células infectadas con patógenos intracelulares. 20

Las vacunas víricas se usan a menudo para inducir una respuesta CTL en un vacunado. Las vacunas víricas son normalmente virus patógenos atenuados por un pase seriado en un cultivo celular o virus muertos mediante calor o inactivación química. Los virus muertos son incapaces de infectar las células y, por lo tanto, como vacunas de subunidades, principalmente provocan una respuesta inmune humoral. Los virus atenuados son capaces de infectar 25 las células y pueden inducir una respuesta CTL en un individuo. Sin embargo, las vacunas víricas atenuadas no están libres de inconvenientes. En primer lugar, la atenuación de un virus a menudo es un proceso de ensayo y error. En segundo lugar, hay un grave problema de seguridad en el uso de virus atenuados, especialmente en los niños, los ancianos y los inmuno-comprometidos. Existe una solución a los problemas de las vacunas bacterianas y víricas tradicionales con los vectores de vacunas bacterianas, tales como Listeria monocytogenes (LM) . LM es un 30 microbio intracelular facultativo gram positivo beta hemolítico.

Actualmente se usan tres métodos para expresar un antígeno heterólogo en Listeria monocytogenes, e incluyen sistemas de expresión basados en plásmidos y sistemas de expresión de cromosomas. Se describe un método basado en un cromosoma en Frankel y col. (1995, J. Immunol. 155: 4775-4782) y Mata y col. (2001, Vaccine 19: 35 1435-1445) . En resumen, se pone un gen que codifica el antígeno de interés, junto con un promotor adecuado y la secuencia de la señal, entre dos regiones de ADN homólogas a una región del cromosoma de Listeria. Esta recombinación homóloga permite la integración específica del antígeno en el cromosoma de Listeria. El cassette que comprende el antígeno y el ADN homólogo está ligado a un plásmido sensible a la temperatura incapaz de replicarse a temperaturas superiores a 40 ºC. El plásmido comprende adicionalmente marcadores de resistencia a 40 fármacos para fines de selección y mantenimiento de plásmido. La manipulación y la replicación de este plásmido tiene lugar generalmente en E. coli, debido a su rápida replicación y facilidad de transformación, en comparación con la Listeria. Puesto que la Listeria es un organismo gram positivo y E. coli es un organismo gram negativo, los genes resistentes a fármacos pueden ser específicos para cada categoría de organismo, o puede haber dos copias del mismo gen resistente a fármacos eficaces en ambos tipos de organismo, pero bajo el control de promotores gram 45 positivos y gram negativos separados. Después del montaje, el plásmido se transforma en LM por conjugación directa con E. coli que comprende el plásmido, o por lisis y aislamiento del plásmido de E. coli, seguido de electroporación de LM competente.

Con el fin de integrar el plásmido en la región deseada del cromosoma de Listeria, se sigue el método de 50 intercambio alélico de dos etapas de Camilli y col. (1992, Mol. Microbiol. 8: 143-157) . En resumen, la Listeria se pasa a más de 40ºC para evitar la replicación plasmídica. La integración del plásmido en el cromosoma de Listeria se selecciona por el crecimiento a 40 ºC en presencia de un fármaco de selección, por ejemplo cloranfenicol. Después de la selección de transformantes, las bacterias se pasan a 30ºC y se seleccionan para comprobar la sensibilidad al fármaco para detectar la Listeria en la que se ha producido la excisión de secuencias de vectores extraños. La 55 desventaja de este método es que el método de intercambio alélico doble es lento y requiere la selección de muchos clones para llegar a una cepa de vacuna adecuada. Se describe un segundo método cromosómico de producción de cepas de Listeria que comprende un antígeno heterólogo por Lauer y col. (2002, J. Bacteriol. 184: 4177-4186) . Este método no requiere intercambio alélico, pero en cambio requiere dos vectores de integración basados en fago. Este método utiliza uno o dos genes de resistencia a fármacos, dando como resultado un organismo de Listeria que comprende resistencia a uno o más fármacos. La desventaja de los métodos de Lauer y col. es la presencia de genes de resistencia a fármacos, que no son considerados seguros debido a la preocupación sobre la propagación de la resistencia antibiótica a microorganismos previamente susceptibles a la terapia antibiótica. Por lo tanto, la presencia de genes de resistencia a los antibióticos en un vector vacunal se considera una obligación desde una 5 perspectiva de seguridad.

Un tercer método de expresión del antígeno extraño en Listeria es expresar el antígeno episomalmente de un plásmido. Este método se describe en Ikonomidis y col. (1994 J. Exp. Med. 180: 2209-2218) y Gunn y col. (2001, J Immunol 167: 6471-6479) . Este método tiene la ventaja de que el gen no tiene que integrarse en el cromosoma y 10 puede expresarse en múltiples copias, lo que puede mejorar la inmunogenicidad. Sin embargo, con el fin de seleccionar los transformantes plasmídicos y asegurar la retención del plásmido durante la propagación in vitro es necesario incluir dos genes de resistencia a fármacos en el plásmido, uno para la construcción del plásmido en E. coli y uno para la propagación de la Listeria monocytogenes transformadas.

Pilgrim S y col.: Bactofection of mammalian cells by Listeria monocytogenes: improvement and mechanism of DNA deliver y ., gene therapy (2003) , vol. 10, Nº 24, páginas 2036-2045, desvela la construcción de un sistema letal equilibrado para la bactofección de células mamíferas.

Thompson RJ y col.: Pathogenicity and immunogenicity of a Listeria monocytogenes strain that requires D-alanine for 20 growth., Infection and Immunity (1998) , vol. 66, Nº 8, páginas 3552-3561, desvela L. monocytogenes que comprenden mutaciones en el gen alanina racemasa y el gen D-aminoácido transferasa.

Por lo tanto, dados los usos demostrados de Listeria como un vector vacunal, son necesarios en el campo métodos para construir vectores vacunales de Listeria sin resistencia antibiótica, aún capaces de provocar una fuerte 25 respuesta inmune.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan cepas vacunales de Listeria que expresan un antígeno heterólogo y una enzima metabólica, y 30 métodos para generar las mismas.

Se proporciona un método de diseño de una cepa vacunal de Listeria para expresar un antígeno heterólogo, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una cepa auxótrofa de Listeria con un plásmido, comprendiendo el plásmido una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende el antígeno 35 heterólogo, y comprendiendo adicionalmente el plásmido una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima metabólica, en el que la cepa auxótrofa de Listeria absorbe el plásmido, y en el que la enzima metabólica complementa una deficiencia metabólica de la cepa auxótrofa de Listeria, diseñando de este modo una cepa vacunal de Listeria para expresar un antígeno heterólogo.

Se proporciona una cepa vacunal de Listeria, que comprende un plásmido, en la que el plásmido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido comprende un antígeno de proteína, y el plásmido comprende adicionalmente una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima metabólica,... [Seguir leyendo]

1. Un método de diseño de una cepa vacunal recombinante de Listeria para expresar un antígeno heterólogo, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una cepa de Listeria auxótrofa para la síntesis de D-alanina que comprende una mutación en un gen D-alanina racemasa y en un gen D-aminoácido transferasa en dicho cromosoma de Listeria con un plásmido, comprendiendo dicho plásmido:

una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un antígeno 10 heterólogo, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una D-alanina racemasa, en el que dicho plásmido no confiere resistencia antibiótica a dicha cepa vacunal auxótrofa de Listeria, 15

en el que dicha cepa auxótrofa de Listeria absorbe dicho plásmido, en el que dicha D-alanina racemasa complementa dicha mutación en dicho gen D-alanina racemasa de dicha cepa bacteriana de Listeria, en el que dicha cepa auxótrofa de Listeria crecerá en ausencia de D-alanina, en el que dicho plásmido comprende un gen prfA, y 20

en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico se une operativamente a un promotor procariota, diseñando así una cepa vacunal recombinante de Listeria para expresar un antígeno heterólogo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende dicho antígeno heterólogo y un polipéptido adicional, en el que dicho polipéptido adicional es un fragmento no 25 hemolítico de una proteína LLO, una secuencia aminoacídica tipo PEST, o una proteína ActA o un fragmento de la misma.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha segunda secuencia de ácido nucleico se une operativamente a una secuencia promotora/reguladora. 30

4. Una cepa vacunal recombinante auxótrofa de Listeria para la síntesis de D-alanina que comprende una mutación en un gen D-alanina racemasa y en un gen D-aminoácido transferasa en dicho cromosoma de Listeria, en la que dicha Listeria comprende adicionalmente un plásmido, en la que el plásmido comprende:

una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende un antígeno heterólogo, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima D-alanina racemasa, en la que dicho plásmido no confiere resistencia antibiótica a dicha cepa vacunal recombinante de Listeria, 40

en la que dicho gen D-alanina racemasa complementa un gen endógeno D-alanina racemasa que carece de un cromosoma de dicha cepa vacunal recombinante de Listeria, en la que dicho plásmido comprende un gen prfA, y en la que dicho plásmido se mantiene de forma estable en dicha cepa vacunal recombinante de Listeria en ausencia de una selección antibiótica, en la que dicha primera secuencia de ácido nucleico se une operativamente a un promotor procariota, y en la que dicha cepa auxótrofa de Listeria crecerá en ausencia de D-alanina. 45

5. La cepa vacunal recombinante de Listeria de la reivindicación 4, en la que dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende dicho antígeno de proteína y un polipéptido adicional, en la que dicho polipéptido adicional es un fragmento no hemolítico de una proteína LLO, una secuencia aminoacídica tipo PEST, o una proteína ActA o un fragmento de la misma. 50

6. La cepa vacunal recombinante de Listeria de la reivindicación 4 o 5, en la que dicha segunda secuencia de ácido nucleico se une operativamente a una secuencia promotora/reguladora.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicha Listeria es útil para inducir una respuesta inmune a 55 linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno infiltrantes de tumor in vivo.

8. La cepa vacunal recombinante de Listeria de la reivindicación 4, en la que dicha Listeria es útil para inducir una respuesta inmune a linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno infiltrantes de tumor in vivo.

9. Una cepa vacunal recombinante de Listeria obtenida de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como un medicamento.

10. Una cepa vacunal recombinante de Listeria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6 para 5 su uso como un medicamento.

11. Una cepa vacunal recombinante de Listeria obtenida de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto induciendo una respuesta inmune a linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno infiltrantes de tumor in vivo. 10

12. Una cepa vacunal recombinante de Listeria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto induciendo una respuesta inmune a linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno infiltrantes de tumor in vivo.