LIGANDOS DE AFINIDAD.

Método para la unión de afinidad de un polipéptido heterólogo de interés,

donde dicho polipéptido se expresa como un polipéptido de fusión de la autoproteasa pestiviral NPro o de sus derivados, y donde dicho polipéptido de fusión se pone en contacto en condiciones caotrópicas con una matriz de afinidad que comprende una fase sólida y un ligando de afinidad que comprende los enlaces peptídicos acoplados a esta fase sólida, donde el ligando de afinidad que comprende el enlace peptídico se selecciona entre el siguiente grupo de ligandos:

a) péptidos que comprenden la fórmula X1X2X3X4, donde X1 a X4 son los residuos de aminoácidos y al menos dos de X1 a X4 son W, Y o F;

b) péptidos que comprende la fórmula X5X6X7X8, donde X5 a X8 son residuos de aminoácidos, al menos uno de X5 a X8 es W, y al menos uno de X5 a X8 es E o D, y

c) poli-aminoácidos que consisten en un monómero de aminoácido del grupo que consiste en R, K, E y D y un monómero de aminoácido del grupo que consiste en S, M y W, preferiblemente poli-KY, poli-KF, poli-KW, poli-RY, poli-RF, poli-RW, poli-EY, poli-DY, poli-EF, poli-EW, poli-DF y poli-DW,

con la condición de que los péptidos de acuerdo con a) y b) tendrán una longitud máxima de 35 aminoácidos y que los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud mínima de 20 residuos de aminoácidos,

y donde dicho polipéptido de fusión se une a dicha matriz en condiciones caotrópicas

Ligandos de afinidad.

La presente invención se refiere a técnicas y materiales de purificación de afinidad, especialmente para cromatografía de afinidad, y ligandos específicos para su uso en tales técnicas. Más específicamente, la invención se refiere a la captación y purificación de N^pro, mutantes de N^pro, proteínas de fusión de N^pro expresados como cuerpos de inclusión en condiciones de desnaturalización o de proteínas con una alta tendencia a la agregación usando cromatografía de afinidad de péptidos.

La cromatografía de afinidad es una de las técnicas más eficaces para el aislamiento específico de un compuesto a partir de una mezcla compleja, bruta. Los anticuerpos se han aplicado satisfactoriamente como ligandos de afinidad debido a su alta selectividad y su alta afinidad. Un inconveniente de estas matrices de afinidad es su relativa inestabilidad que puede conducir a la lixiviación de los anticuerpos de la matriz de soporte en el producto. Por otro lado la regeneración con tampones alcalinos, que es un procedimiento común en la industria biofarmacéutica, puede conducir a la desnaturalización irreversible y a la pérdida de eficacia de la unión. Los péptidos cortos son capaces de reemplazar a los anticuerpos como ligandos de afinidad. Estas moléculas pequeñas ofrecen alta estabilidad química, eficiencia, selectividad, precio bajo y generalmente no son tóxicos. Estas características se consideran una ventaja frente a ligandos proteicos, especialmente cuando se aplican en un entorno biofarmacéutico. Los péptidos dirigidos contra una molécula diana se pueden identificar a partir de bibliotecas peptídicas combinatorias o bibliotecas biológicas. Las bibliotecas combinatorias sintetizadas químicamente incluyen síntesis pin, bolsita de té, SPOT. Las bibliotecas biológicas incluyen técnicas de presentación en fagos, presentación en bacterias, técnicas ribosomales.

Por otro lado, una gran cantidad de proteínas muestran una gran tendencia a agregarse en condiciones fisiológicas o su actividad biológica inherente es la agregación como se postuló para las proteínas priónicas o los péptidos amiloides. Con el fin de estudiar estas proteínas éstas tienen que ser solubilizadas en condiciones caotrópicas, mediante la adición de detergentes, en presencia de disoluciones acuosas con pH extremo (ácido o alcalino) y adición de disolventes orgánicos, tales como acetonitrilo, etanol, isopropanol, propanol, piridina. Esto suele ser problemático, si no imposible, especialmente si las proteínas no deben verse perjudicados en su actividad para llevar a cabo nuevas investigaciones después de la solubilización/purificación.

Los materiales comunes aplicados en la cromatografía de afinidad son generalmente compañeros de unión de unión potencial en condiciones cosmotrópicas o fisiológicas, pero no caotrópicas. En consecuencia, los componentes purificados por afinidad con frecuencia eluyen del material de la cromatografía de afinidad mediante la aplicación de condiciones caotrópicas.

La solicitud de patente internacional WO 01/11057 se refiere a un procedimiento para la producción recombinante de una proteína de fusión que comprende una autoproteasa pestiviral N^pro.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la unión de afinidad de un polipéptido heterólogo de interés, donde dicho polipéptido se expresa como polipéptido de fusión de la autoproteasa pestiviral N^pro o de sus derivados, y donde dicho polipéptido de fusión se pone en contacto en condiciones caotrópicas con una matriz de afinidad que comprende una fase sólida y un ligando de afinidad que comprende los enlaces peptídicos acoplados a esta fase sólida en la que el ligando de afinidad que comprende el enlace peptídico se selecciona entre el siguiente grupo de ligandos:

con la condición de que los péptidos de acuerdo con a) y b) tienen una extensión máxima de 35 residuos de aminoácidos y que los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud mínima de 20 residuos de aminoácidos, y donde dicho polipéptido de fusión está unido a dicha matriz en condiciones caotrópicas.

Preferiblemente, los péptidos de acuerdo con a) y b) (también referidos en la presente memoria como "oligopéptidos"), tienen una longitud de 5 a 12, especialmente de 6 a 8, residuos de aminoácidos. Preferiblemente, está presente al menos un aminoácido cargado positivamente en estos oligopéptidos. Los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud preferida de al menos 35 residuos de aminoácidos, más preferida de al menos 50 residuos de aminoácidos, especialmente de al menos 100 residuos de aminoácidos. Los poli-aminoácidos específicamente preferidos son por ejemplo, los poli-aminoácidos disponibles comercialmente para medios de cultivo, tales como poli-KW, 4:1 (PM 20.000 a 50.000 Da; producto SIGMA Núm. P9285), poli-KY, 4:1 (PM 20.000 a 50.000 Da, producto SIGMA Núm. P4695) o poli-KF, 1:1 (PM 20.000 a 50.000 Da, producto SIGMA Núm. P3150).

El ligando de afinidad utilizado en el método de acuerdo con la presente invención puede ser modificado químicamente, especialmente acetilado, esterificado, amidado, oxidado, reducido o provisto de una molécula conectora.

El ligando de afinidad es conectado preferiblemente a la matriz sólida mediante enlaces covalentes. Los ligandos de afinidad y las matrices de acuerdo con la presente invención tienen una alta afinidad para unirse a N^pro, sus derivados y sus proteínas de fusión que se pueden expresar como cuerpos de inclusión. Específicamente, estos ligandos o matrices afinidad se unen a N^pro, sus derivados y sus proteínas de fusión en condiciones caotrópicas, al menos a la porción N^pro por ejemplo de una proteína de fusión. Los ligandos de afinidad de acuerdo con la presente invención ejercen un alto grado de especificidad por su capacidad para unirse selectivamente a N^pro, derivados de N^pro y sus polipéptidos de fusión en condiciones de desnaturalización. Dentro del alcance de la presente invención, tal ligando de afinidad se dirige contra la parte del polipéptido de fusión de acuerdo con la invención que ejerce la función autoproteolítica. Como material de la fase sólida, todos los materiales que ya se aplican en el presente campo son apropiados. Preferiblemente, la fase sólida se selecciona del grupo que consiste en material cromatográfico, especialmente soportes a base de celulosa, agarosa, acrilamida, poli(estireno-divinilbenceno) o copolímeros de metacrilato de etilenglicol, placas de microtitulación, membranas de nitrocelulosa, microchips, placas de vidrio, o soportes revestidos con metales.

De acuerdo con la presente invención se pueden utilizar diversos tipos de soportes en fase sólida, tales como los soportes a base de celulosa, agarosa (geles Sepharose o Macro-Prep), dextrano (geles Sephadex), acrilamida (geles Sephacryl, Trisacryl), sílice (geles TSK, SW), poli(estireno-divinilbenceno) (geles Source o Poros), copolímeros de metacrilato de etilenglicol (geles Toyopearl HW, TSK, PW, Fractogel EMD) o mezclas, en particular de agarosa y dextrano (gel Superdex). Los soportes aprobados para uso humano o veterinario por las autoridades competentes Estadounidenses (FDA para la alimentación y la administración de fármacos) o los organismos de la Unión Europea serán seleccionados más específicamente. Además, el soporte seleccionado debe estar unido, preferiblemente mediante enlace covalente, al ligando de afinidad de acuerdo con la presente invención (se dice que el soporte está funcionalizado). La matriz en fase sólida puede comprender, como armazón de la matriz, cualquier material...

1. Método para la unión de afinidad de un polipéptido heterólogo de interés, donde dicho polipéptido se expresa como un polipéptido de fusión de la autoproteasa pestiviral N^Pro o de sus derivados, y donde dicho polipéptido de fusión se pone en contacto en condiciones caotrópicas con una matriz de afinidad que comprende una fase sólida y un ligando de afinidad que comprende los enlaces peptídicos acoplados a esta fase sólida, donde el ligando de afinidad que comprende el enlace peptídico se selecciona entre el siguiente grupo de ligandos:

con la condición de que los péptidos de acuerdo con a) y b) tendrán una longitud máxima de 35 aminoácidos y que los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud mínima de 20 residuos de aminoácidos,

y donde dicho polipéptido de fusión se une a dicha matriz en condiciones caotrópicas.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde los péptidos de acuerdo con a) y b) tienen una longitud de 5 a 12, especialmente de 6 a 8, residuos de aminoácidos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el ligando de afinidad está químicamente modificado, especialmente acetilado, esterificado, amidado, oxidado, reducido o provisto de una molécula conectora.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la fase sólida se selecciona del grupo que consiste en material cromatográfico, especialmente soportes con una base de celulosa, agarosa, acrilamida, poli(estireno-divinilbenceno) o copolímeros de metacrilato de etilenglicol, placas de microtitulación, membranas de nitrocelulosa, microchips, placas de vidrio o soportes revestidos con metal.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el ligando de afinidad se selecciona del grupo que consiste en VSDDWY, VSEDWY, VSIDWY, VSYDWY, VSVDWY, VSWDWY, VSYDWY, VSFDWY, VSDEWY, VSEEWY, VSIEWY, VSYEWY, VSVEWY, VSWEWY, VSYEWY, VSFEWY, DDDDWY, DDEDWY, DDIDWY, DDYDWY, DDVDWY, DDWDWY, DDYDWY, DDFDWY, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VS LIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLEEW, VSDLDW, VSDLEW, VSYIDW, VSYIWE, VSIDWY, VSIEWY, VSIWWY, VSIIWY, VSYIWY, VSVIWY, VSFIWY, VSFIWE, VSIFEW, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VS LIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLIEW, WSLIEW, FSYFEW, FSFYEW, WSFYEW, FSYIEW, WSYIEW, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AFFRWYA, AFGRWYA, AFHRWYA, AFIRWYA, AFLRWYA, AFMRWYA, AFNRWYA, AFPRWYA, AFQRWYA, AFRRWYA, AFSRWYA, AFTRWYA, AFVRWYA, AFYRWYA, AFYFW YA, AFYGWYA, AFYLWYA, AFYMWYA, AFYNWYA, AFYPWYA, AFYTWYA, AFYVWYA, AFYWWYA, AF YYWYA, AKWFRYA, VSRNWY, ASRNWYA, ASRFWYA, FSRNWYA, VFRNWYA, VWRNWYA, VYRNW YA, VSRAWYA, VSRFWYA, VSRWWYA, VSRYWYA, VSRNFYA, VSRNYYA, VSRNWFA, VSRNWWA, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYRWYKK, Ac-AFYRWYK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFFRWYAK, Ac-AFGRWYAK, Ac-AFH RWYAK, Ac-AFIRWYAK, Ac-AFLRWYAK, Ac-AFMRWYAK,- Ac-AFNRWYAK, Ac-AFPRWYAK, Ac-AFQRW YAK, Ac-AFRRWYAK, Ac-AFSRWYAK, Ac-AFTRWYAK, Ac-AFVRWYAK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFYFWYAK, Ac-AFYGWYAK, Ac-AFYLWYAK, Ac-AFYMWYAK, Ac-AFYNWYAK, Ac-AFYPWYAK, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYVWYAK, Ac-AFYWWYAK, Ac-AFYYWYAK, Ac-AKWFRYAK, Ac-VSRNWYK, Ac-ASRNWYAK, Ac-AS RFWYAK, Ac-FSRNWYAK, Ac-VFRNWYAK, Ac-VWRNWYAK, Ac-VYRNWYAK, Ac-VSRAWYAK, Ac-VSR FWYAK, Ac-VSRWWYAK, Ac-VSRYWYAK, Ac-VSRNFYAK, Ac-VSRNYYAK, Ac-VSRNWFAK, Ac-VSRNW WAK, YWKA, Ac-YWKAK, YKYA, Ac-YKYAK, YWRA, Ac-YWRAK, ARWY, Ac-ARWYK, YWRA y Ac-YW RAK.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de afinidad se une covalentemente a la fase sólida.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho polipéptido de fusión en una preparación líquida de partida se pone en contacto con dicha matriz de afinidad en condiciones caotrópicas por medio de lo cual dicho polipéptido de fusión se une a dicha matriz de afinidad y se separa de dicha preparación líquida de partida.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho polipéptido de fusión unido a la matriz de afinidad se transforma adicionalmente mientras está unido a dicha matriz de afinidad.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho polipéptido de fusión se une a la matriz de afinidad o dicho polipéptido de fusión transformado se hace eluir de la matriz de afinidad, preferiblemente aplicando un tampón de elución con un menor carácter caotrópico como preparación líquida de partida.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho polipéptido de fusión se expresa como cuerpos de inclusión en condiciones desnaturalizantes.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la autoproteasa N^Pro pestiviral o dicho derivado de la misma se selecciona del grupo que consiste en

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicho polipéptido de fusión comprende una proteína o fracción proteica que tiene una gran tendencia a agregarse en condiciones fisiológicas, en especial una proteína seleccionada del grupo que consiste en Péptidos Aß, Proteína priónica Tau, a-sinucleína, Tau, Péptido ADan, Péptido ABri, Cistatina C, Péptidos Aß, Superóxido dismutasa, Atrofina 1, Huntingtina, Ataxinas, Receptor de andrógenos, Proteína de unión a la caja TATA, Cadenas ligeras de Ig, Amiloide del Suero A, Transtiretina, Transtiretina, Microglobulina ß2, Apolipoproteína A-1, Gelsolina, Polipéptido amiloide pro-islotes, Procalcitonina, Factor natriurético atrial, Lisozima, Insulina, Fibrinógeno, proteínas completas o fragmentos específicos, mutantes, variantes o expansiones polyQ.