Procedimiento de producción de un mutante aleatorio de gen exógeno,

en el que se introduce un constructo de ADN que comprende por lo menos los (a) a (d) siguientes en una célula animal y se produce el mutante de gen exógeno en la célula animal:

(a) un promotor de VH, en el que dicho promotor de VH comprende la secuencia de SEC ID nº: 14;

(b) un gen exógeno;

(c) un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen JH de cadena pesada y el gen Cµ; y

(d) un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasaI HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN de las secuencias de SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2

Procedimiento para la construcción de un mutante.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la producción de un mutante, que comprende introducir un constructo de ADN mejorado en células animales, el constructo de ADN, y un kit para producir un mutante de gen o para expresar un gen mutante.

Antecedentes de la técnica

Los seres vivos existentes actualmente han evolucionado durante un periodo de tiempo prolongado mediante mutagénesis y la selección de mutantes por parte del medio ambiente. La evolución general presenta una velocidad muy lenta y un avance requiere muchas generaciones. Por otra parte, en el caso de las células productoras de anticuerpos del sistema inmunológico, la mutagénesis y la selección por parte de antígenos se completan en una generación, y la generación siguiente no heredará la función adquirida. Esta velocidad de evolución tan rápida del sistema inmunológico se interpreta que se opone a las mutaciones de un microorganismo patogénico dependiente del medio ambiente.

El presente inventor previamente ha producido ratones transgénicos en los que se han introducido genes del enzima cloranfenicol acetiltransferasa de origen bacteriano, y ha demostrado que la mutación de un gen de anticuerpo se encuentra controlada por su promotor e intensificador, y la mutación de cualquier gen puede inducirse mediante el control con un promotor e intensificador de un gen de anticuerpo (Azuma T. et al., Int. Immunology 5(2):121-130, 1992).

El procedimiento para la producción de un mutante utilizado actualmente es uno de los métodos de producción de mutantes en los que se introduce convenientemente una mutación por deleción, inserción y/o adición en una secuencia de ADN deseada, es decir, mutagénesis sitio-específica para sustituir sitio-específicamente una determinada longitud de secuencias de ADN (Site-specific mutagenesis, Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10:6487-6500, 1982; Zoller et al., Methods in Enzymol. 100:468-500, 1983). En la mutación por desapareamiento general utilizando un oligonucleótido sintetizado artificialmente como cebador, se sintetiza un oligonucleótido complementario consistente constituido por aproximadamente 20 bases con una mutación opcional en una secuencia de bases próxima a un sitio en el que debe inducirse una mutación, se híbrida el oligonucleótido con una ADN diana, produciendo de esta manera una ADN complementario al resto del ADN diana utilizando un ADN polimerasa. De esta manera resulta posible introducir una mutación deseada en un sitio deseado. Sin embargo, este método no puede inducir muchos mutantes simultáneamente.

En los demás sistemas de mutagénesis, se ha examinado la desaparición o la manifestación de una función específica en presencia de un compuesto que daña un gen (Myers et al., Science 232:613-618, 1986), mientras que se han utilizado además bacterias, etc. Sin embargo, estos métodos son fundamentalmente diferentes del método anteriormente indicado del presente inventor para la inducción de una mutación.

Se genera variación (diversidad) en la región IgV de ratones y seres humanos mediante la unión combinatorial de segmentos génicos V, D y J, que existen separadamente en la línea germinal, la deleción y adición de nucleótidos en la unión de estos segmentos durante la unión, y la hipermutación somática de los genes V-(D)-J unidos. La hipermutación somática se relaciona con la maduración de afinidad de los anticuerpos y se ha observado frecuentemente tras la estimulación de los antígenos dependientes de células T (TD) (Bothwell A.L.M. et al., Cell 24:625, 1981; Gearhart P.J. et al., Nature 291:29, 1981; Griffiths G.M. et al., Nature 312:271, 1984; Maizels N. et al., Cell 43:715, 1985; Wysocki L.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1847, 1986; Cumano A. et al., EMBO. J. 5:2459, 1986; Berek C. et al., Cell 67:1121, 1991; Taketani M. et al., Mol. Immunol. 32:983, 1995; Furukawa K. et al., Immunity 11:329, 1999:2-10). Los elementos de acción en cis responsables de la inducción de la hipermutación somática han sido identificados utilizando la cadena ? (O'Brien R.L. et al., Nature 326:405, 1987; Sharpe M.J. et al., Eur. J. Immunol. 20:1379, 1990; Sharpe M.J. et al., EMBO J. 10:2139, 1991; Betz A.G. et al., Cell 77:239, 1994; Yelamos J. et al., Nature 376:225, 1995; Peters A. et al., Immunity 4:57, 1996:11-16), la cadena ? (Klotz E. et al., J. Immunol. 157:4458, 1996:17) y ratones transgénicos de cadena H (Durdik J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2346, 1989; Sohn J. et al., J. Exp. Med. 177:493, 1993; Tumas-Brundage, K.M. y Manser T., J. Exp. Med. 185:239, 1997:18-20).

Tal como se ha indicado anteriormente, el presente inventor preparó ratones transgénicos portadores del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), que se encuentra controlado por V_H17.2.25 (Loh D.Y. et al., Cell 33:85, 1983; Grosschedl R. y Baltimore D., Cell 41:885, 1985:22,23) y el intensificador del intrón J-C (en adelante abreviado Eµ) (Gillies S.D. et al., Cell 33:715, 1983; Banerji J. et al., Cell 33:729, 1983:24,25)/región de unión a matriz (en adelante abreviado MAR) (Forrester W.C. et al., Science 265:1221, 1994:26). Como resultado, se detectó hipermutación somática en CAT, pero no en el promotor V_H o en Eµ/MAR flanqueantes. Sin embargo, la frecuencia de mutación era aproximadamente 1/10 de la observada en V_H-D-J_H endógena, sugiriendo que estos elementos de acción en cis resultan críticos o importantes para la inducción de la hipermutación y que otros componentes, tales como C?, Ca en situación 3' o el intensificador flanqueante de Ca (intensificador 3') (Pettersson S. et al., Nature 344:165, 1990; Dariavach P. et al., Eur. J. Immunol. 21:1499, 1991; Lieberson R. et al., EMBO. J. 14:6229, 1995:27-29) podrían ser responsables de hipermutación somática de elevada frecuencia (Sohn J. et al., J. Exp. Med. 177:493, 1993; Tumas-Brundage K.M. y Manser T., J. Exp. Med. 185:239, 1997; Giusti A.M. y Manser T., J. Exp. Med. 177:793, 1997:19,20,30).

Exposición de la invención

Con el fin de identificar el componente o componentes importantes para incrementar la frecuencia de hipermutación en el gen IgH, el presente inventor utilizó blastocitos deficientes en RAG-2 Gen de activación de recombinación: sistema de complemento de blastocisto proteína-2 de disposición génica, desarrollado por Chen et al. (Chen J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4528, 1993:31)). Se microinyectó una serie de constructos de transgén que diferían únicamente en la región 3'-flanqueante en blastocistos deficientes en RAG-2 para transfectar células madre embrionarias (en adelante abreviadas "células ES"). Los ratones quiméricos obtenidos en este sistema se inmunizaron con un antígeno dependiente de células T.

Como resultado, la frecuencia de la hipermutación somática en V_H-D-J_H del transgén reveló que la inserción de la región 3b sensible a la ADNasa I (en adelante, HS3b) y/o HS4 (Madisen L. y Groudine M., Genes Dev. 8:2212, 1994; Michaelson J.S. et al., Nucleic Acids Res. 23:975, 1995; Arulampalam V. et al., Immunol. Today 18:549, 1997:32-34) induce hipermutación somática aleatoria.

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento de producción para un mutante aleatorio, en el que se introduce en una célula animal un constructo de ADN en el que se encuentran ligados un promotor eucariótico modificado, una secuencia de ADN externa, un intensificador de intrón y un intensificador HS3/4 3'. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para obtener un gen mutante mediante la expresión del constructo de ADN en una célula animal. Se ha descubierto un constructo de ADN para producir dicho mutante y un kit para producir un mutante de gen o para expresar el mutante, realizando de esta manera la presente invención. Además, un producto de expresión mutante obtenido a partir del sistema de expresión utilizando células animales implica que ha sido sometido al cribado de toxicidad frente a células animales.

La presente invención proporciona los ítems 1 a 6 siguientes:

Ítem 1. Un procedimiento de producción en una célula animal de un gen mutante aleatorio exógeno, en el que se introduce un constructo de ADN que comprende por lo menos los puntos (a)-(d) siguientes, y en el que...

1. Procedimiento de producción de un mutante aleatorio de gen exógeno, en el que se introduce un constructo de ADN que comprende por lo menos los (a) a (d) siguientes en una célula animal y se produce el mutante de gen exógeno en la célula animal:

2. Procedimiento de producción según la reivindicación 1, en el que la célula animal es una célula animal de una línea de células B.

3. Procedimiento de producción según la reivindicación 2, en el que la célula animal de una línea de células B se deriva de una célula de una línea de linfocitos pre-B.

4. Procedimiento de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además obtener un producto de expresión de dicho gen mutante mediante la expresión de dicho mutante de gen exógeno en la célula animal.

5. Constructo de ADN para la producción de un mutante de gen exógeno, que comprende por lo menos:

6. Kit para el procedimiento de producción de un mutante de gen exógeno o la producción de un producto de expresión de un gen mutante, que comprende un vector que presenta:

con el fin de llevar a cabo la expresión de una secuencia de ADN mutada que produce un mutante de gen exógeno.