INTERCALADORES CON UNA ALTA AFINIDAD PARA LA UNION A ADN Y METODOS DE USO.

Un compuesto representado por la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que A- es un contraión monovalente aceptable

Intercaladores con una alta afinidad para la unión a ADN y métodos de uso.

Antecedentes

La presente invención se refiere a compuestos intercaladores, y al uso de dichos compuestos, comprendiendo cada uno de ellos una fracción de intercalador sustituida, derivatizada con una cadena funcionalizada, teniendo dichos compuestos una alta afinidad para la unión con una molécula de ADN. Estos compuestos intercaladores presentan una mejor unión con una molécula de ADN dentro de las metodologías conocidas que requieren la inserción de intercalador en la molécula de ADN. Además, la invención se refiere a una unión mejorada de moléculas de ADN mediante un segmento que funciona como intercalador utilizado en etiquetado, captura, inserción terapéutica, ensayo y similares, con un mejor rendimiento del intercalador gracias a la mayor eficiencia de uso de los compuestos.

El término "intercalador" fue introducido en el campo de la química hace unos 30 años para describir la inserción de compuestos heteroaromáticos o aromáticos planares entre pares de base adyacentes de ADN de doble hebra (ADNds). Muchas compuestos intercaladores de ADN dan lugar a propiedades interesantes biológicamente. Por lo general, se coincide en que estas propiedades están relacionadas con su reactividad con ADN. En la investigación para encontrar compuestos más activos, resulta lógico que se diseñen moléculas con la afinidad más alta posible para ADN. En la década de 1990, se describió que los complejos de homodímero de etidio con ADNds actuaban a relaciones de un dímero por cada cuatro a cinco pares de base, y eran estables para electroforesis sobre geles de agarosa. Esto permitía fluorescencia, detección y cuantificación de fragmentos de ADN con una sensibilidad de picograma tras la separación y completa ausencia de la mancha de fondo. Se ha buscado tal resultado a través de distintas manipulaciones de compuestos intercaladores, como por ejemplo, mediante compuestos funcionales compuestos de colorantes de intercalado de ADN. Como resultado de estas tentativas, se han utilizado agentes de intercalado de ADN empleando bromuro de etidio en diversos procedimientos de análisis de ADN.

Se han utilizado varios agentes de intercalado de ADN descritos utilizando bromuro de etidio en multitud de procedimientos de análisis de ADN, como por ejemplo:

Christen y cols., "An Ethidium Bromide-Agarose Plate Assay for the Nonradioactive Detection of CDNA Synthesis", Anal. Biochem., 178 (2), 1 mayo, 1989, pp. 269-272, describe el uso de bromuro de etidio para determinar el éxito de las reacciones de síntesis de ADNc. Dado que se puede utilizar el bromuro de etidio en agarosa para cuantificar ARN y ADN, las condiciones en las que se utiliza una mayor fluorescencia de ADN de doble hebra estaban diseñadas para ensayar la síntesis de ADN de doble hebra a partir de ARNm. El bromuro de etidio a 5 microgramos/ml en agarosa permitió una detección cuantitativa de ADNc en el intervalo de 0,03 a 0,0015 microgramos. Dodecil sulfato sódico tuvo un efecto negativo en la medida de ADNc. Tras el análisis de ADNc por electroforosis de gel alcalino y el manchado en 5 microgramos/ml de bromuro de etidio permitió una secuenciación rápida y precisa de ADNc y requirió solamente de 0,01 a 0,05 microgramos de ADNc.

Petersen, S.E., "Accuracy and Reliability of Flow Cytometry DNA Analysis Using a Simple, One-Step Ethidium Bromide Staining Protocol", Cytometry, 7(4), julio, 1986, pp. 301-306, describe la investigación de fuentes de variación y error para un análisis citométrico de flujo simple del contenido de ADN de núcleos aislados con detergente manchados con bromuro de etidio.

En "Ethidium Bromide in the Detection of Antibodies to DNA and of Circulating DNA by Two-Stage Counterinmunoelectrophoresis", J. Immunol. Methods, 85(1), 17 de dic. 1985, pp. 217-220, Riboldi, y cols., se describe que la utilización de bromuro de etidio en un intento por superar las limitaciones de la contrainmunoelectroforesis en la detección de anticuerpos anti-ADN en precipitación o ADN en circulación, para aumentar la visibilidad de líneas de precipitación y para confirmar su especificidad.

W.A. Denny describió en "DNA-Intercalating Ligands as Anti-Cancer Drugs: Prospects for Future Design" Anticancer Drug Des., 4(4), Dec., 1989, pp. 241-263, que el interés por ligandos de intercalado de ADN como fármacos contra el cáncer se ha desarrollado enormemente desde el éxito clínico de doxorubicina.

Se ha descrito una serie de agentes para el etiquetado de ácidos nucleicos, ya sea sonda o diana, para facilitar la detección de ácido nucleico diana. Las etiquetas adecuadas pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción de rayos X o absorción, magnetismo o actividad enzimática e incluyen, por ejemplo, fluoroforos, cromóforos, isótopos radioactivos, enzimas y ligandos que tienen socios de unión específicos.

Los colorantes fluorescentes son adecuados para detectar ácidos nucleicos. Por ejemplo, bromuro de etidio es un agente de intercalado que presenta una mayor fluorescencia cuando se une a ADN de doble hebra que cuando está en solución libre. El bromuro de etidio se puede utilizar para detectar ácidos nucleicos tanto de hebra simple como doble, si bien la afinidad del bromuro de etidio para un ácido nucleico de hebra simple es relativamente baja. Se utiliza bromuro de etidio de manera rutinaria para detectar ácidos nucleicos tras electroforesis de gel. Tras el fraccionado de tamaño en una matriz de gel aproximada, por ejemplo, agarosa o acrilamida, se empapa el gel en una solución diluida de bromuro de etidio.

Se ha descrito el uso de sondas de polinucleótido etiquetadas con fluorescencia y ensayos de hibridación de polinucleótido. De acuerdo con estos métodos, se preparan sondas uniendo una fracción de absorbedor emisor concreta a los extremos de tres cebadores y cinco cebadores de los fragmentos de ácido nucleico. Los fragmentos tienen la capacidad de hibridarse con posiciones adyacentes de un ADN diana de manera que si ambos fragmentos se hibridan, la proximidad de las fracciones absorbedora y emisora tiene como resultado una fluorescencia emisora detectable. De acuerdo con estos métodos, se introduce el colorante fluorescente en el ADN diana una vez que se han completado todas las polimerizaciones de ácido nucleico in vitro. Se han descrito los efectos inhibidores de los agentes de intercalado de ácido nucleico polimerasa en numerosas localizaciones.

Los colorantes de unión de ADN son útiles como antibióticos por los efectos inhibidores de los procesos de replicación de ácido nucleico que son resultado de la unión del agente con la plantilla. Se ha descrito el uso de agentes de intercalado para bloquear la infectividad del virus de la gripe o herpes. Se ha descrito y presentado informes también de que una serie de agentes de unión a ADN, tanto intercaladores como no intercaladores, inhiben la replicación de ácido nucleico. Por ejemplo, bromuro de etidio inhibe la replicación de ADN.

Se ha proporcionado métodos para la detección de un ácido nucleico diana en una muestra. Dichos métodos comprenden las etapas de (a) proporcionar una mezcla de reacción ampliada que comprende una muestra, un agente de unión a ADN, caracterizándose dicho agente por proporcionar una señal detectable cuando está unido a ácido nucleico de hebra doble, distinguiéndose dicha señal de la señal que proporciona dicho agente cuando está sin unir, y reactivos para amplificación; (b) determinar la cantidad de señal producida por una mezcla de la etapa (a); (c) tratar dicha mezcla en condiciones para amplificación del ácido nucleico diana; (d) determinar la cantidad de dicha señal producida por la mezcla de la etapa (c); y (e) determinar si se ha producido la amplificación. Estos agentes de intercalado de unión de ADN, como bromuro de etidio o homodímero de etidio, permiten un estudio fluorométrico de la interacción de diversas moléculas con ADN.

El agente de intercalado útil para la unión de ADN o la detección de ácidos nucleicos ampliados es un agente o una fracción que tiene la capacidad de insertarse entre el par de base apilado en la doble hélice de ácido nucleico. Los agentes de intercalado, como homodímero de etidio y bromuro de etidio, emiten fluorescencia de manera más intensa cuando se intercalan en el ADN de doble hebra que cuando están unidos a un ADN de hebra simple, ARN o en solución. Otros usos de intercaladores se han aplicado al campo de la separación y aislamiento o purificación de ácidos nucleicos desde especímenes...

1. Un compuesto representado por la fórmula:

en la que A^- es un contraión monovalente aceptable.

2. Un compuesto representado por la fórmula:

en la que A^- es un contraión monovalente aceptable.