HAPLOTIPO DEL GEN ENPP1 (PC-1) ASOCIADO CON EL RIESGO DE OBESIDAD Y DIABETES DE TIPO 2, Y SUS APLICACIONES.

Método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN,

comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

a) determinar en por lo menos un alelo génico o secuencia de ARN que codifica la proteína ENPP1, si dicha secuencia, o fragmentos de la misma contiene el haplotipo que comprende los tres SNP siguientes:

- K121Q,

- IVS20 delT-11, y

- un SNP localizado en la secuencia del dominio 3''UTR, y en el que la primera secuencia de tipo natural del dominio 3''UTR de 1170 pb (incluyendo el codón TGA) tiene la secuencia SEC ID nº 15; y

b) observar si el sujeto tiene o no un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si dicha secuencia, o sus fragmentos, contiene dicho haplotipo, indicando la presencia de dicho haplotipo que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad

Haplotipo del gen ENPP1 (PC-1) asociado con el riesgo de obesidad y diabetes de tipo 2, y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a un método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar obesidad o una patología relacionada con la obesidad, determinando la presencia de un haplotipo que comprende tres SNP específicos en una muestra de ADN o ARN de este sujeto, y/o una concentración elevada de proteína ENPP1 en el suero. La presente invención también se refiere a un kit y a una secuencia nucleica aislada, a un vector o a una célula recombinante que comprende dicho haplotipo del gen ENPP1. La invención comprende además un método para seleccionar un compuesto para el tratamiento o prevención de la obesidad o patología relacionada con la obesidad, y un método para determinar la eficacia de un fármaco para reducir el riesgo de obesidad o patología relacionada con la obesidad en un paciente.

La obesidad es una enfermedad devastadora. Además de dañar la salud física, la obesidad puede hacer estragos sobre la salud mental debido a que la obesidad afecta a la autoestima, que finalmente puede afectar a la capacidad de una persona para interactuar socialmente con los demás. Desafortunadamente, la obesidad no es bien entendida, y los estereotipos y suposiciones sociales con respecto a la obesidad sólo tienden a exacerbar los efectos psicológicos de la enfermedad. Debido al impacto de la obesidad sobre individuos y sobre la sociedad, se ha gastado mucho esfuerzo para encontrar vías para tratar la obesidad, pero se ha tenido poco éxito en un tratamiento a largo plazo y/o prevención de la obesidad.

La obesidad representa el trastorno más extendido del peso corporal, y es el trastorno nutricional más importante en el mundo occidental, cuya extensión se estima que oscila desde el 30% hasta el 50% en la población de mediana edad. La obesidad, definida como un exceso de grasa corporal con relación a la masa corporal magra, también contribuye a otras enfermedades. Por ejemplo, este trastorno es responsable del aumento de la incidencia de enfermedades tales como arteriopatía coronaria, hipertensión, apoplejía, diabetes, hiperlipidemia, y algunos cánceres. La obesidad no es simplemente un problema de comportamiento, es decir, el resultado de hiperfagia voluntaria. Más bien, la composición corporal diferencial observada entre sujetos obesos y normales resulta de las diferencias tanto en el metabolismo como en interacciones neurológicas/metabólicas. Estas diferencias parecen deberse, en cierto grado, a diferencias en la expresión génica, y/o al nivel de productos o actividad génicos. La epidemiología de la obesidad muestra de forma contundente que el trastorno presenta características heredadas.

En resumen, por lo tanto, la obesidad, que plantea un problema de salud importante a nivel mundial, representa un rasgo complejo, altamente heredable. Dada la gravedad, prevalencia, y heterogeneidad potencial de tales trastornos, existe una gran necesidad de identificar aquellos genes que participan en el control de la obesidad, particularmente para ser capaces de anticipar el riesgo de desarrollar esta patología o una patología relacionada con la obesidad, y/o para desarrollar mejores medicamentos selectivos. Este es el objeto de la presente invención.

Un trabajo previo identificó un locus de la obesidad en la niñez en el cromosoma 6q16.3-q24.2 (puntuación lod = 4,06)¹ que incluye una región de 2,4 Mb relacionada con la diabetes de tipo 2/obesidad, común a los ocho barridos genómicos publicados que dan a conocer una relación en esta región^1-8.

El documento de patente US 6.465.185 B1 describe el uso de anticuerpos para la determinación de la proteína PC-1 y un par de cebadores para amplificar el exón 4 de la proteína PC-1.

Se han llevado a cabo estudios de asociación de genotipo-fenotipo en una región ENPP1 de 580 kb, y estudios de expresión de ARNm de ENPP1, en 3.147 caucásicos franceses y en más de 6.000 individuos europeos.

El gen ENPP1 codifica la ecto-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 1 (ENPP1), que es un miembro de la familia de ecto-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa (ENPP). La proteína codificada es una glicoproteína transmembránica de tipo II que comprende dos subunidades idénticas enlazadas por disulfuro. Esta proteína tiene una amplia especificidad y escinde una variedad de sustratos, incluyendo enlaces de fosfodiéster de nucleótidos y azúcares de nucleótidos, y enlaces de pirofosfato de nucleótidos y azúcares de nucleótidos. Esta proteína puede funcionar para hidrolizar 5'-trifosfatos de nucleósidos en sus monofosfatos correspondientes, y también puede hidrolizar polifosfatos de diadenosina. Las mutaciones en este gen, particularmente, se han asociado con calcificación arterial infantil "idiopática" (GLU893TER, ARG774CYS o LEU579PHE), osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna vertebral (OPLL) (IVS20AS, 1-BP DEL,T,-11), y resistencia a insulina (LYS121 GLN, la mutación "K121 Q").

Se ha demostrado que existe una fuerte asociación entre la variante de este gen ENPP1, particularmente un haplotipo de riesgo de tres alelos (K121Q; IVS20 delT-11 y un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR (principalmente A>G +1044 TGA, QdeITG), y la obesidad de la niñez y adultos con obesidad mórbida. También se ha demostrado que la presencia de por lo menos un alelo del haplotipo de riesgo estaba asociada con aumento de niveles séricos de la proteína ENPP1 soluble en niños, sugiriendo una expresión adicional elevada de ENPP1. Además, se encontró que la expresión de una isoforma larga de ARNm de ENPP1, que comprende el SNP A>G +1044 TGA, asociado con la obesidad, era específica de tres tejidos de principal importancia para la homeostasis de la glucosa: las células D pancreáticas de los islotes, los adipositos y el hígado. Estos hallazgos demuestran por primera vez un papel principal para varias variantes de ENPP1 en la mediación de la resistencia a insulina, tanto en el desarrollo de la obesidad como de diabetes de tipo 2 (T2D), proporcionando un mecanismo molecular común de ambas aflicciones extendidas ampliamente.

También se han proporcionado ensayos de detección que se pueden usar para diagnosticar el riesgo de desarrollar obesidad y/o patología relacionada con la obesidad, y para identificar moléculas para el tratamiento terapéutico.

La presente invención describe un método para determinar si un sujeto tiene mayor riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra biológica procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas de:

También se describe un método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad a partir de una muestra biológica procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas de:

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para determinar si un sujeto tiene...

1. Método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

2. Método según la reivindicación 1, en el que la patología relacionada con obesidad se selecciona de entre el grupo que consiste en diabetes de tipo 2, hipertensión, hipercolesterolemia e hiperlipidemia.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la patología relacionada con la obesidad es diabetes de tipo 2.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, el que dicho SNP localizado en el dominio 3'UTR se selecciona de entre el grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA, A>C +1092 TGA y C>T +1157 TGA.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho SNP localizado en el dominio 3'UTR se selecciona de entre el grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA y A>C +1092 TGA.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicho SNP localizado en el dominio 3'UTR es de A>G +1044 TGA.

7. Método para determinar si un sujeto está en un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad, caracterizado porque dicho método comprende la etapa a) y b) del método según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que:

8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7 en el que la etapa a) de determinación de la presencia o ausencia de dicho haplotipo de riesgo de tres alelos se lleva a cabo mediante un método que comprende una etapa de amplificación de la secuencia de ADN genómico o ARN, o sus fragmentos, susceptible de contener dichos SNP aplotípicos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

9. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa de PCR se lleva a cabo a partir de ADN genómico, ARNm o ADNc, eventualmente después de una etapa de transcripción inversa, o sus fragmentos, usando los siguientes conjuntos de cebadores:

10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha muestra biológica es una muestra de hígado, adipocitos o células beta pancreáticas cuando la presencia de dicho haplotipo se determina en la secuencia de ARN o sus fragmentos.

11. Método para determinar si un sujeto está en riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad a partir de una muestra de plasma o suero procedente de dicho sujeto, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha concentración significativa mayor de proteína ENPP1 sérica o plasmática corresponde a por lo menos más de 10%, preferentemente más de 15% de la concentración sérica o plasmática normal.

13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que dicha concentración de proteína ENPP1 sérica o plasmática se determina usando anticuerpos capaces de reconocer específicamente la proteína ENPP1.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque dichos anticuerpos se ponen en contacto con el suero o plasma a ensayar, en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico específico entre la proteína ENPP1 y dicho anticuerpo, y porque se cuantifican los complejos inmunológicos formados.

15. Método según una de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la patología relacionada con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en diabetes de tipo 2, hipertensión, hipercolesterolemia e hiperlipidemia.

16. Método según una de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la patología relacionada con obesidad es diabetes de tipo 2.

17. Kit para determinar si un sujeto está en riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad, que comprende por lo menos un par de cebadores o un conjunto de un par de cebadores capaces de amplificar un fragmento de ADN genómico o ARN que codifica la proteína ENPP1 y susceptible de contener el haplotipo que comprende los tres siguientes SNP:

y en el que dicho por lo menos conjunto de un par de cebadores es:

18. Kit para determinar si un sujeto está en riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad, que comprende por lo menos un par de cebadores o un conjunto de un par de cebadores capaces de amplificar un fragmento de ADN genómico o ARN que codifica la proteína ENPP1 y susceptible de contener el haplotipo que comprende los tres siguientes SNP:

y en el que dicho por lo menos conjunto de un par de cebadores es:

19. Secuencia nucleica variante aislada, o secuencia complementaria de la misma, de un mamífero, preferentemente ser humano, secuencia genómica o de ARN del gen que codifica la proteína ENPP1, caracterizada porque dicha secuencia nucleica variante aislada comprende por lo menos la presencia del haplotipo que comprende los tres siguientes SNP como se define en las reivindicaciones 1 y 4 a 6.

20. Vector de clonación y/o de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 19.

21. Célula hospedante transformada mediante un vector según la reivindicación 20.

22. Mamífero transgénico, excepto ser humano, caracterizado porque comprende una célula transformada según la reivindicación 21, o una célula que contiene un gen ENPP1 funcional recombinante que comprende por lo menos el haplotipo que comprende los tres siguientes SNP como se define en las reivindicaciones 1 y 4 a 6.

23. Uso de célula según la reivindicación 21 o un animal transgénico según la reivindicación 22, para seleccionar compuestos químicos o bioquímicos para el tratamiento o la prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad.

24. Método para seleccionar un compuesto químico o bioquímico para el tratamiento la prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad, caracterizado porque comprende la etapa de:

25. Método para seleccionar un compuesto químico o bioquímico para el tratamiento o prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad según la reivindicación 24, caracterizado porque:

seleccionándose dicho compuesto químico o bioquímico si se observa una disminución de dicha concentración.