GRANZIMA B DEPENDIENTE DE PEPTIDOS HSP70/HSP70 COMO INDUCTORA DE APOPTOSIS EN CELULAS TUMORALES.

Procedimiento ex vivo de inducción o mejora de la expresión de la granzima B en células natural killer (NK) que comprende poner en contacto células NK con

(a)proteína Hsp70;

(b)un fragmento (C-terminal) de (a) que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG;

(c)un (poli)péptido que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; o

(d)una combinación de (a), (b) y/o (c)

Granzima B dependiente de péptidos Hsp70/Hsp70 como inductora de apóptosis en células tumorales.

La presente invención se refiere a un procedimiento para inducir o aumentar la expresión de la granzima B en células citotóxicas naturales o natural killer (NK). Además, la presente invención se refiere a la granzima B para su utilización en el tratamiento de tumores, donde las células tumorales expresan Hsp 70 en su superficie celular.

Se ha encontrado que los niveles citoplásmicos elevados de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70) protegen las células tumorales contra la muerte celular programada (Nylandsted et. al. (2000) Ann. N.Y. Acad. Sci. 926, 122). La Hsp70 es la forma inducible de estrés más importante de la familia de proteínas de choque térmico (HSP), que se encuentra principalmente localizada en el cytosol. Los resultados acumulados durante los últimos años han demostrado que las HSPs unidas a la membrana plasmática y localizada extracelular son altamente inmunogénicas y exponen a las células a un ataque inmune (Schild et. al. (1999) Current Opinion in Immunology 11, 109). Tras la captación mediada por receptor (Amold-Schild et. al. (1999) J. Immunol. 162, 3757) y de nuevo la presentación por células presentadoras de antígeno (APC), los péptidos acompañantes de HSP provocan la destrucción de las células, respuesta de las células CD8⁺ T (Suto et. al. (1995) Science 269, 1585). Se han identificado varios receptores, que incluyen CD91 y receptores tipo Toll 2 y 4 (TLR2/4), que median la interacción de complejos peptídicos HSP90 (gp96), HSP70 (Hsp70, Hsc70) y HSP6 0 con APCs (Basu et. al. (2001) Immunity 14, 303; Binder et. al. (2000) Nat. Immunol. 1, 151; Sondermann et. al. (2000) Biol. Chem. 3 81, 1165.; Ohashi et. al. (2000) J. Immunol. 164, 558). Se ha descrito "el efecto acompañante" independiente de péptido por los miembros del grupo HSP70. La unión de HSP70 exógeno a monocitos vía TLR2/4 en un patrón dependiente de CD14 induce la agrupación de receptores y la secreción de citoquinas proinflamatorias vía transducción de la señal MyD88/IRAK/NF?-B (Pfeiffer et. al. (2001) Eur. J. Immunol. 31, 3153; Asea et. al. (2000) Nature Medicine, 6, 435; Asea et. al. (2000) Cell Stress & Chaperones, 5, 425; Asea et. al. (2002) J Biol Chem. 277 (17), 15028).

Se ha encontrado que las células (NK) natural killer interactúan específicamente con un epítope localizado C-terminal de Hsp70 (Botzler et. al. (1998) Cell Stress & Chaperones, 3, 6), que se presenta en la membrana celular de las células tumorales (Multhoff et. al. (1995) Int. J. Cancer, 61, 272; Multhoff et. al. (1997) J. Immunol. 158, 4341). La cantidad de Hsp70 unida a la membrana en las células tumorales se correlaciona positivamente con la intensidad de lisis mediada por las células NK: Se ha encontrado que el estrés físico (calor) así como químico (fármacos citostáticos) aumentan la expresión en la superficie celular de Hsp70 en células tumorales y, por lo tanto, representan las mejores dianas para las células NK (Multhoff (1997) Int. J. Hyperthermia 13, 39; Botzler et. al. (1999) Exp. Hematol. 27, 470; Rabinovich et. al. (2 000) J. Immunol. 165, 23 90; Feng et. al. (2001) Blood 97, 3505). La incubación de células NK purificadas con proteína Hsp70 recombinante aumenta su actividad citolítica contra las células tumorales positivas a la membrana de Hsp70 (Multhoff et. al. (1999) Exp. Hematology 27, 1627). Se consigue el mismo efecto mediante un péptido de 14 aminoácidos, terminado TKD (TKDNNLLGRFELSG, aa450-463), derivado de la C-terminal del dominio Hsp70. Esta región corresponde al dominio Hsp70 expuesta a un medio extracelular de células tumorales viables (Multhoff et. al. (2001) Cell Stress & Chaperones 6, 337). Concomitante con un aumento de la actividad citolítica, tras el contacto con la Hsp70 o con Hsp70-péptido TDK, la expresión de la superficie celular de la forma activa del receptor de lectina CD94 tipo-C se ha mejorado en las células NK. Los análisis de bloqueo que utilizan un anticuerpo inhibidor específico de CD94 revelaron una participación de CD94 en la interacción de las células NK con las células tumorales positivas a la membrana de Hsp70 (Multhoff et. al. (1999) Exp. Hematología 27,1627). Estos datos indican que, aparte de péptidos líder que presentan HLA-E de alelos HLA clásicos (Lanier et. al. (1998) Inmunidad 8.693; Braud et. al. (1998) Naturaleza 391, 795), el terminal localizado Hsp70-secuencia de péptido TKD podría considerarse un ligando potencial para un aún complejo receptor CD94 activador indefinido. A pesar de que las observaciones anteriores indican que las funciones de Hsp70-péptido como un estructura de reconocimiento diana selectiva al tumor para las células NK positivas CD94 (Multhoff et. Al. (1997) J. Immunol. 158,4341), el mecanismo por el cual las células NK lisan las células diana tumorales positivas Hsp70 queda todavía por dilucidar. Además, es preferible estimular específicamente la actividad lítica de las células NK hacia células tumorales de la manera más específica que hasta ahora sea posible. Todos estos objetivos científicos sirven como medios para encontrar un enfoque más eficaz y más específico en el tratamiento de enfermedades y, en particular, en el tratamiento de tumores.

Se han hecho informes de la expresión en superficie de proteínas de choque térmico que incluyen la Hsp70 para encontrar también después infección vírica o en respuesta al estrés. En particular, se encontró Hsp70 en membrana en células limfoides infectadas por HIV (Di Cesare et al.(1992), Immunology 76, 341) y en líneas celulares de conejos infectados por HTLV I (Chouchane et al. (1994), J. Infect. Dis. 169, 253). De forma parecida, es concebible que las células infectadas por bacterias o afectadas por inflamación expresen Hsp70 en sus superficies celulares. En consecuencia, la actividad lítica de las células NK o granzima B puede estar dirigida hacia células infectadas por virus o bacterias así como hacia células afectadas por inflamación.

El estado de la técnica también incluye las siguientes divulgaciones: WO 99/49881: Efectos antitumorales de células NK en células tumorales que expresan en la superficie celular Hsp70 (ejemplos 2 y 3), WO 01/80880: se hace referencia a las páginas 7 y 8 para la producción de granzina B por células NK activadas.

Por tanto, el problema técnico que plantea la presente invención es proporcionar medios y procedimientos para el tratamiento específico de enfermedades y, en particular, de tumores, infecciones víricas y bacterianas y enfermedades inflamatorias.

La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento ex vivo de inducción o mejora de la expresión de la granzima B en células (NK) natural killer que comprende poner en contacto células NK con

La granzima B es una proteasa serina bien conocida en el estado de la técnica y se ha descrito que está implicada en el proceso de la apóptosis/muerte celular programada (Berke (1995) Cell, 81(1), 9-12; Froelich et. al. (1998) Immunology Today, 19(1), 30-26); Metkar S et al. Apoptosis mediada por gránulos de células citotóxicas: las perforinas liberan complejos de serglicina de granzima B en la células diana sin información de poro de la membrana plasmática, Inmunidad 16 (2002), 417-428.

Esta encima promueve la fragmentación del ADN por desdoblamiento de procaspasas en sus formas activadas y, por lo tanto, induce la muerte celular programada a través de la ruta inhibida Bcl-2. La granzima B empieza a inducir el proceso de apoptosis después de la presencia en el cytosol de una célula diana.

El término "células NK" ("células natural killer") comprende linfocitos granulares grandes que expresan CD45 en la superficie y que muestran actividad para matar sin estimulación previa. Están especialmente...

1. Procedimiento ex vivo de inducción o mejora de la expresión de la granzima B en células natural killer (NK) que comprende poner en contacto células NK con

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la proteína Hsp70, el fragmento (C-terminal) de la misma, el (poli)péptido que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG o una combinación de estos está en un estado no complejado.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además proporcionar células NK con expresión de granzima B mejorada o inducida útil para la reinfusión en un mamífero.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, donde las células NK son células NK autólogas y/o alélicas.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, donde dicho mamífero es un humano.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho contacto se realiza durante por lo menos 12 h.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde dicho contacto ser realiza por lo menos durante 4 días.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dichas células NK antes de ponerse en contacto con, se obtienen a partir de células de médula ósea mediante la incubación de dichas células de médula ósea con interleucina-15 (IL-15) y el factor de células madre (SCF) a concentraciones de 1 ng/ml - 1000 ng/ml por citoquina durante por lo menos 7 días y hasta 4 meses.

9. Granzima B para utilizar en el tratamiento in vivo de tumores independiente de la ruta perforina donde dichos tumores expresan Hsp70 en la superficie celular.

10. Granzima B según la reivindicación 9, que se utiliza como único compuesto farmacéuticamente aceptable.

11. Granzima B según la reivindicación 9 ó 10, que está diseñada para administrarse a una concentración final de 1 µg/ml a 500 µg/ml, preferiblemente de 1 µg/ml a 10 ng/ml y más preferiblemente a una concentración final de aproximadamente 6 ng/ml.

12. Granzima B según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que se empaqueta en liposomas.

13. Granzima B según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde dichos tumores se seleccionan entre el grupo que consiste en estómago, gástrico, colorrectal, páncreas, mama, pulmón, ginecológico, cáncer de cabeza y cuello, dermatológico (por ejemplo, el melanoma), tumores neuronales, leucemia y linfoma.