FARMACOS Y PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR LA HIPOXIA Y PROCEDIMIENTOS DE SELECCION DE LOS ANTERIORES.
Un procedimiento para identificar moduladores de la prolil hidroxilasa,
que comprende las etapas
a)poner en contacto pVHL, una prolil hidroxilasa, un modulador putativo de la prolil hidroxilasa y una proteína de fusión que genera luz que comprende a) un resto polipéptido HIFalpha que tiene carácter de unión para la prolil hidroxilasa y que tiene la capacidad de unirse a una proteína VHL de tipo natural, de tal manera que la unión es capaz, en un entorno celular normóxico, de dirigir el polipéptido HIFalpha para su destrucción; y b) un resto polipéptido que genera luz, en el que la generación de luz de dicho resto polipéptido que genera luz cambia tras la unión de una prolil hidroxilasa a dicho resto polipéptido HIFalpha, bajo condiciones favorables para la unión de una prolil hidroxilasa con un HIFalpha para formar una muestra de ensayo; y b)determinar la capacidad de dicho modulador putativo de la prolil hidroxilasa para modular la prolil hidroxilasa midiendo la luz generada en dicha muestra de ensayo. en el que dicho resto polipéptido HIFalpha es un resto polipéptido HIF1alpha que comprende la secuencia de aminoácidos Y-X1-Leu-X2-Proh-X3-X4-X5-X6-Y'', en la que
a)Proh es prolina hidroxilable; b)X1, X2, X4, X5, y X6 son de manera independiente Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, o Trp; c)X3 es Ser, Thr, o Tyr; y d)Y e Y'' están presentes o ausentes de manera independiente y, si están presentes, comprenden de manera independiente un péptido que tiene de 1 a 600 aminoácidos
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US02/08886.
Solicitante: DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 44 BINNEY STREET,BOSTON, MA 02115.
Inventor/es: KAELIN,WILLIAM,G, IVAN,MIRCEA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 4 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K31/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos.
- A61K31/70 A61K […] › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047).
- A61K38/02 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos de número indeterminado de aminoácidos; Sus derivados.
- A61K38/44 A61K 38/00 […] › Oxidoreductasas (1).
- C12Q1/26 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una oxidorreductasa.
- G01N33/573 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para enzimas o isoenzimas.
Clasificación PCT:
- A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
- C12Q1/00 C12Q […] › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
- C12Q1/26 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una oxidorreductasa.
- G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
- G01N33/542 G01N 33/00 […] › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
Clasificación antigua:
- A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
- C12Q1/00 C12Q […] › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
Fragmento de la descripción:
Fármacos y procedimientos para tratar la hipoxia y procedimientos de selección de los anteriores.
Antecedentes de la invención
Cómo las células detectan los cambios en el oxígeno ambiental es un problema fundamental de la biología. En las células de mamíferos, la carencia de oxígeno, o hipoxia, conduce a la estabilización de un factor de transcripción de unión con el ADN específico de la secuencia denominado HIF (factor inducible por hipoxia) que activa transcripcionalmente una variedad de genes relacionados con procesos tales como la angiogénesis y el metabolismo de la glucosa.
La isquemia del tejido es una causa principal de morbilidad y mortalidad. La isquemia puede ser el resultado de la hipoxia crónica producida por la carencia de suministro de sangre al tejido que se produce por, por ejemplo, apoplejía, trombosis de las venas profundas, émbolo pulmonar, e insuficiencia renal. Se encuentra también tejido isquémico en los tumores.
El HIF se une al ADN como un heterodímero constituido por una subunidad alfa y una subunidad beta (denominada también translocador nuclear del receptor de hidrocarburo de arilo o ARNT). La subunidad alfa se poliubiquitina rápidamente y se degrada en presencia de oxígeno mientras que la subunidad beta es constitutivamente estable. La enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) es un síndrome de cáncer hereditario caracterizado por el desarrollo de tumores muy vasculares que sobreproducen ARNm inducible por hipoxia tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El productor del gen supresor del tumor VHL, pVHL, es un componente del complejo multiproteína que contiene elongina B, elongina C, Cul2, y Rbx1. Este complejo soporta una similaridad estructural y funcional con las ubiquitina ligasas de SCF (Skp1/Cdc53 o Culina/Secuencia F). En presencia de oxígeno, pVHL se une directamente con las subunidades HIFa y las dirige hacia la poliubiquitinación y la destrucción. Las células que carecen de pVHL funcional no pueden degradar HIF y de esta manera, sobreproducen los ARNm de los genes directores de HIF.
Este proceso es fundamental en la proliferación celular normal y está perturbado durante la proliferación celular aberrante, tal como en el cáncer.
El documento WO 00/69908 se refiere a la sugerencia de que la proteína supresora del tumor VHL regula las subunidades HIFa dirigiendo HIFa hacia la destrucción en células normóxicas pero no hipóxicas. Se dan a conocer ensayos para los moduladores de esta interacción y los péptidos basados en las secuencias HIFa que pueden modular esta interacción.
Jaakkola y col (2001) Science 292 (5516): 468-472 sugieren que la interacción entre el pVHL y una región específica de la subunidad HIF-1a está regulada mediante la hidroxilación de un resto de prolina (P564) por un enzima que se denomina HIFa prolil hidroxilasa. Los inventores proponen que el requerimiento de dioxígeno como cosustrato y hierro como cofactor sugiere que la HIFa prolil hidroxilasa funciona directamente como sensor del oxígeno celular.
Resumen de la invención
La invención proporciona un procedimiento para identificar moduladores de la prolil hidroxilasa tal como se define en las reivindicaciones 1-5.
La invención se refiere en parte al uso de proteínas de fusión que generan luz (o células que expresan la proteína de fusión que genera luz), en el que la proteína de fusión que genera luz caracteriza un sitio de unión a ligando y un resto polipéptido que genera luz. La proteína de fusión que genera luz (LGP
) tiene una propiedad en la que la generación de luz del resto polipéptido que genera luz cambia tras la unión de un ligando en el sitio de unión a ligando. El ligando puede ser activo en un entorno sólo bajo ciertas condiciones, por ejemplo, en un estado hipóxico, de tal manera que la proteína de fusión que genera luz se enciende o apaga
sólo bajo ciertas condiciones.
La invención proporciona también un procedimiento para seleccionar moduladores de la propil hidroxilasa asociados con la hipoxia, tal como se define en las reivindicaciones 6-7.
Breve descripción de los dibujos
La Fig 1 es una representación esquemática de diferentes proteínas de fusión de la presente invención.
La Fig 2 es una segunda representación esquemática de diferentes proteínas de fusión de la invención.
La Fig 3 muestra la unión de pVHL con una forma modificada de HIF.
La Fig 4 muestra la unión de pVHL con un péptido derivado de HIF1a si Leu562 y Pro564 están intactos.
La Fig 5 muestra la ubiquitinación y la degradación de HIF unido a Leu562 y Pro 564.
La Fig 6 representa gráficamente la hidroxilación de la prolina unida a la unión de pVHL.
La Fig 7 ilustra el pVHL que reconoce específicamente HIFa con la prolina 564 hidroxilada.
Las Figs 15-18 ilustran los resultados obtenidos en el Ejemplo de Referencia 2.
La Fig 19 ilustra la secuencia de tipo natural de HIFa, con Nº de Acceso Q16665 (SEC DE ID Nº: 10).
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Por conveniencia, se recogen aquí algunos términos usados en la memoria, los ejemplos, y las reivindicaciones adjuntas.
Resto polipéptido HIFa
incluye todo o parte de las secuencias de aminoácidos de HIF1a, HIF2a, o HIF3a.
Resto polipéptido HIF1a
incluye todo o parte de las secuencias de aminoácidos de HIF1a, por ejemplo, la SEC DE ID Nº: 10, la secuencia que corresponde a los restos 1-600 N terminales de HIF1a, numerada de acuerdo con el HIF1a de tipo natural, o la secuencia de aminoácidos 4 a 12 que corresponde a los restos adyacentes a y/o que rodean el resto 402 y/o el resto 564, inclusive, de HIF1a, siendo los restos 402 y/o 564 prolina o prolina hidroxilada. Esto comprende además la secuencia de aminoácidos especificada en las reivindicaciones.
Sitio efector colineal
incluye las regiones del resto polipéptido que genera luz que, cuando actúan en episodios posteriores a la unión del ligando, provocan que el resto polipéptido que genera luz cambie su estado de emisión de luz actual (es decir, encendido o apagado). Estas regiones hacen que el sitio efector colineal pueda conseguir esto mediante, por ejemplo, distorsión conformacional, modificación química, por ejemplo, ubiquitinación de un resto o restos en el sitio efector colineal, o mediante rotura de una porción de todo o parte del sitio efector colineal.
Que tiene carácter de unión para la prolil hidroxilasa
se refiere a una propiedad que tienen los restos del polipéptido HIFa adecuada para, por ejemplo, procedimientos de selección de la invención, e incluye las secuencias del polipéptido HIF adecuadas o adaptadas para la unión de la propil hidroxilasa así como las secuencias HIF de tipo no elaborado o natural a las que pVHL reconoce y con las que se une.
Que tiene carácter de unión para la ubiquitina ligasa
se refiere a una propiedad que tienen los restos del polipéptido HIFa adecuada para, por ejemplo, los procedimientos de selección de la invención, que incluyen, por ejemplo, las secuencias del polipéptido HIF natural que tienen restos de prolina hidroxilada, hidroxilados por la prolina hidroxilasa, o, por ejemplo, restos del polipéptido HIF1a
tal como se define en el presente documento.
Localización
incluye determinar la región concreta del sujeto de una entidad de interés, por ejemplo, un tumor.
Kemptido
incluye un sustrato péptido sintético de AMPc que corresponde a la parte de la secuencia del sitio de fosforilación de la piruvato quinasa en el hígado de porcino. Malantido
incluye el sustrato C de la proteína quinasa dependiente de AMPc y de la proteína quinasa en diversos tejidos.
Molécula pequeña
incluye las composiciones que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y lo más preferible de menos de aproximadamente 4 kD. Moléculas pequeñas pueden ser, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Diseminación de la infección
incluye la diseminación y colonización por un patógeno de otros sitios de huéspedes diferentes del sitio inicial de la infección. El término puede incluir también, sin embargo, el crecimiento en tamaño y el número de patógenos en el sitio inicial de la infección.
Ligando
incluye una molécula,...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para identificar moduladores de la prolil hidroxilasa, que comprende las etapas
en el que dicho resto polipéptido HIFa es un resto polipéptido HIF1a que comprende la secuencia de aminoácidos Y-X1-Leu-X2-Proh-X3-X4-X5-X6-Y', en la que
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la unión de la prolil hidroxilasa a dicho resto polipéptido HIFa cambia la luminiscencia de dicho resto polipéptido que genera luz sin alterar el estado de fosforilación de dicha proteína de fusión.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho resto polipéptido HIF1a comprende los aminoácidos 555-575 del HIFa de tipo natural, numerados de acuerdo con el HIF1a humano, o sus regiones equivalentes en otras proteínas de la subunidad HIFa.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho resto polipéptido HIFa comprende la secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 1-600 N terminales de HIFa, numerados de acuerdo con el HIF1a humano, o sus regiones equivalentes en otras proteínas de la subunidad HIFa, en el que o bien a) el resto 564 es prolina hidroxilable o bien b) el resto 402 es prolina hidroxilable; o bien c) ambos restos 402 y 564 son prolina hidroxilable.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho resto polipéptido HIFa comprende o bien (a) una secuencia de 12 a 14 aminoácidos; o bien (b) una secuencia de 20 a 30 aminoácidos; o bien (c) una secuencia de 80 a 120 aminoácidos, correspondiendo dicha secuencia de aminoácidos a los restos adyacentes a y/o que rodean el resto 564, inclusive, de HIF1a, numerados de acuerdo con el HIF1a humano, o sus regiones equivalentes en otras proteínas de la subunidad HIFa, siendo el resto 564 prolina hidroxilable.
6. Un procedimiento para seleccionar un modulador de prolil hidroxilasa asociado con la hipoxia, comprendiendo dicho procedimiento:
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el trastorno se selecciona entre el grupo constituido por cáncer, diabetes, cardiopatía y apoplejía.
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