Un constructo de ADN que comprende: un primer y un segundo casete de expresión,

en la que dicho primer casete de expresión en conexión operativa comprende (i) un promotor de actina 1 de arroz, (ii) un intrón de actina 1 de arroz, (iii) una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, (iv) una molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato y (v) una molécula de ADN terminador transcripcional; y

dicho segundo casete de expresión comprende en conexión operativa (a) un promotor del CaMV 35S, (b) un intrón Hsp70, (c) una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, (d) una molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato y (e) una molécula de ADN terminador transcripcional

Evento de maíz PV-ZMGT32 (nk603) y composiciones y procedimientos para detección del mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un constructo de ADN que confiere a las plantas tolerancia al glifosato, a su uso para preparar una planta de maíz que tolere la aplicación de herbicida glifosato y a una planta de maíz transgénica tolerante al glifosato y a semillas de la misma que comprenden el constructo.

Antecedentes de la invención

El maíz es un cultivo importante y es una fuente de alimento principal en muchas zonas del mundo. Se han aplicado al maíz los procedimientos de biotecnología para mejorar los rasgos agronómicos y la calidad del producto. Un rasgo agronómico semejante es la tolerancia a herbicidas, en particular tolerancia al herbicida glifosato. Este rasgo en maíz se ha conferido mediante la expresión de un transgén en las plantas de maíz (patente de los Estados Unidos Nº.: 6.040.497).

La expresión de genes extraños en plantas se conoce por estar influida por su posición cromosómica, debido quizás a la estructura de cromatina (por ejemplo heterocromatina) o la proximidad de elementos reguladores transcripcionales (por ejemplo, potenciadores) cerca del sitio de integración (Weising y col., Ann. Rev. Genet. 22: 421-427, 1988). Por esta razón, a menudo es necesario someter a una revisión un gran número de eventos con el fin de identificar un evento caracterizado por la expresión óptima de un gen introducido de interés. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en niveles de expresión de genes introducidos entre eventos. Puede haber también diferencias entre patrones espaciales o temporales de expresión, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales, que puede no corresponder a los patrones esperados de elementos reguladores presentes en el constructo génico introducido. Por esta razón, es común producir cientos o miles de eventos diferentes y someter a una revisión aquellos eventos para un evento simple que tiene niveles y patrones de expresión transgénica deseados para propósitos comerciales. Un evento que tiene niveles y patrones de expresión transgénica deseados es útil para introducir el transgén dentro de otros antecedentes genéticos mediante cruzamiento sexual usando procedimientos de reproducción convencionales. La progenie de tales cruces mantiene las características de expresión transgénica del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar una expresión génica fiable en un número de variedades que están bien adaptadas a las condiciones de crecimiento locales.

Sería ventajoso poder detectar la presencia de un evento en particular con el fin de determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un procedimiento para detectar un evento en particular sería útil para cumplir con las regulaciones que requieren la aprobación anterior a la comercialización y etiquetado de alimentos derivados de plantas de cultivo recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier procedimiento de detección de ácidos nucleicos bien conocido tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Estos procedimientos de detección generalmente se centran en elementos genéticos usados frecuentemente, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como resultado, tales procedimientos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes elementos, particularmente los producidos usando el mismo constructo de ADN, a menos que se conozca la secuencia de ADN del ADN cromosómico adyacente al ADN insertado ("ADN flanqueante"). Un ensayo de PCR específico de evento se discute, por ejemplo, por Windels y col. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b: 459-462, 1999), quienes identificaron el evento 40-3-2 de soja tolerante a glifosato mediante PCR usando un grupo de cebadores que abarcan el empalme entre el inserto y el ADN flanqueante, específicamente un cebador que incluye una secuencia del inserto y un segundo cebador que incluye una secuencia del ADN flanqueante.

La patente de Estados Unidos 5,948,956 menciona un vector específico pMON25496 y su uso para transformar plantas; las secuencias funcionales de dicho vector no se desvelan completamente en dicho documento.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un constructo de ADN que cuando se expresa en células vegetales y plantas confiere tolerancia a herbicida de glifosato. La presente invención se refiere preferiblemente a los procedimientos para producir y seleccionar una planta de cultivo monocotiledónea tolerante a glifosato. El constructo de ADN está constituido por dos casetes de expresión transgénicos. El primer casete de expresión comprende una molécula de ADN de un promotor de actina 1 de arroz (Oryza sativa) y un intrón de actina 1 de arroz unido operativamente a una molécula de ADN que codifica una secuencia de péptido de tránsito de cloroplasto, conectada operativamente a una molécula de ADN que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a una molécula de ADN que comprende un terminador transcripcional 3'. El segundo casete de expresión transgénica del constructo de ADN comprende una molécula de ADN del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, conectada operativamente a una molécula de ADN que comprende un intrón Hsp70, conectada operativamente a una molécula de ADN que codifica una secuencia peptídica de transito de cloroplasto, unida operativamente a una molécula de ADN que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a una molécula de ADN que comprende un terminador transcripcional 3'.

De modo más específico, se proporciona un constructo de ADN que cuando se expresa en células vegetales y en plantas confiere tolerancia al herbicida glifosato. Esta invención se refiere preferentemente a los procedimientos para producir y seleccionar una planta de maíz tolerante a glifosato. El constructo de ADN está constituido por dos casetes de expresión transgénica. El primer casete de expresión está constituido por una molécula de ADN de un promotor de actina 1 de arroz (Oryza sativa) y un intrón de actina 1 de arroz unido operativamente a una molécula de ADN que codifica una secuencia peptídica de tránsito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis, conectada operativamente a una molécula de ADN que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una molécula de ADN que consta de un terminador transcripcional de nopalina sintasa. El segundo casete de expresión consta de una molécula de ADN del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S que contiene una duplicación en tándem de la región potenciadora, conectada operativamente a una molécula de ADN que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una molécula de ADN que está constituida por un terminador transcripcional de nopalina sintasa.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una planta de maíz tolerante al herbicida glifosato que comprende transformar una célula de maíz con un constructo de ADN definido anteriormente en el presente documento (pMON25496), seleccionar la célula de maíz para tolerancia al tratamiento con una dosis eficaz de glifosato y cultivar la célula de maíz en una planta de maíz fértil. La planta de maíz fértil puede autopolizarse o cruzarse con variedades de maíz compatibles para producir progenie tolerante al glifosato.

La presente invención se refiere a las plantas y semillas de maíz tolerante al glifosato que comprenden el constructo de ADN tal como se ha definido anteriormente en el presente documento, tales como una línea de maíz (Zea mais).

Lo precedente y otros aspectos de la invención llegarán a ser más patentes a partir de la siguiente descripción detallada y dibujos acompañantes.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Mapa de plásmido de pMON25496.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención...

1. Un constructo de ADN que comprende: un primer y un segundo casete de expresión, en la que dicho primer casete de expresión en conexión operativa comprende (i) un promotor de actina 1 de arroz, (ii) un intrón de actina 1 de arroz, (iii) una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, (iv) una molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato y (v) una molécula de ADN terminador transcripcional; y

dicho segundo casete de expresión comprende en conexión operativa (a) un promotor del CaMV 35S, (b) un intrón Hsp70, (c) una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, (d) una molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato y (e) una molécula de ADN terminador transcripcional.

2. El constructo de ADN de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato consta de una molécula de ADN de AGRTU.aroA:CP4.

3. Un procedimiento para producir una planta de maíz que tolera la aplicación de herbicida glifosato que comprende:

(a) transformar una célula de maíz con el constructo de ADN de la reivindicación 1;

(b) seleccionar dicha célula de maíz para tolerancia a la aplicación de glifosato;

(c) cultivar dicha célula de maíz en una planta de maíz fértil.

4. Una planta de maíz transgénica tolerante a glifosato y semillas de la misma que comprenden el constructo de ADN de la reivindicación 1.