EPOTILONA D CRISTALINA.

Epotilona D cristalina

Epotilona D cristalina.

Campo de la invención

La presente invención proporciona formas cristalinas de epotilona D y procedimientos para obtener las formas cristalinas. La invención se refiere a los campos de la agricultura, química, química médica, medicina, biología molecular, y farmacología.

Antecedentes de la invención

Los policétidos constituyen un tipo de compuestos estructuralmente diversos sintetizados, al menos en parte, a partir de dos compuestos que son bloques construcción de unidades de carbono mediante una serie de condensaciones de tipo Claisen y modificaciones posteriores. Los policétidos incluyen antibióticos tales como tetraciclina y eritromicina, agentes anticancerosos tales como las epotilonas y daunomicina, e inmunosupresores tales como FK506, FK520, y rapamicina. Los policétidos se producen naturalmente en muchos tipos de organismos, entre los que se que incluyen hongos y bacterias miceliales. Los policétidos se sintetizan in vivo mediante las enzimas policétido sintasas denominadas comúnmente como enzimas PKS. Se conocen dos tipos principales de PKS que difieren en su estructura y en la manera en la que sintetizan los policétidos. Estos dos tipo se denominan comúnmente como enzimas PKS de Tipo I o modular y de Tipo II o iterativo (aromático).

Las enzimas PKS modulares son normalmente complejos multiproteína en los que cada proteína contiene múltiples emplazamientos activos, cada uno de los cuales se usa únicamente una vez durante el ensamblaje y la modificación de la cadena de carbono. Las enzimas PKS iterativas son normalmente complejos multiproteína en los que cada proteína contiene únicamente uno o como máximo dos emplazamientos activos, cada uno de los cuales se usa múltiples veces durante el ensamblaje y la modificación de la cadena de carbono. Se han clonado un gran número de genes de las enzimas PKS modulares y aromáticas.

Los genes PKS modulares están compuestos por secuencias de codificación organizadas para codificar un módulo de carga, numerosos módulos extensores, y una región de liberación. Tal como se describe más completamente a continuación, cada una de estas regiones y módulos corresponden a un polipéptido con una o más funciones específicas. En general, el módulo de carga es responsable de la unión del primer bloque de construcción usado para sintetizar el policétido y transferirlo al primer módulo extensor. Los bloques de construcción usados para formar policétidos complejos son normalmente aciltioésteres, más comúnmente acetilo, propionilo, malonilo, metilmalonilo, hidroximalonilo, metoximalonilo, y etilmalonilo CoA. Otros bloques de construcción incluyen aminoácidos y aciltioésteres del tipo de los aminoácidos. Las PKS catalizan la biosíntesis de policétidos mediante repetidas condensaciones decarboxilativas de tipo Claisen entre los bloques de construcción del aciltioéster. Cada módulo es responsable de la unión a un bloque de construcción, llevando a cabo una o más funciones en este bloque de construcción, y de transferir el compuesto resultante al siguiente módulo El siguiente módulo, a su vez, es responsable de unir el siguiente bloque de construcción y transferir el compuesto en crecimiento al siguiente módulo hasta que se completa la síntesis. En este punto, la región de liberación, a menudo la actividad de una tioesterasa enzimática (TE), rompe el policétido a partir de la PKS.

Los procedimientos recombinantes para manipular genes PKS modulares e iterativos se describen en las Patentes de los Estados Unidos N^os 5.962.290; 5.672.491; 5.712.146; 5.830.750; y 5.843.718; y en las solicitudes de patente PCT N^os 98/49315 y 97/02358. Estas y otras patentes describen los vectores de expresión recombinante para la producción heteróloga de policétidos así como los genes PKS recombinantes ensamblados combinando partes de dos o más genes diferentes o agrupaciones de genes que producen policétidos novedosos. Hasta la fecha, se han usado dichos procedimientos para producir policétidos conocidos o novedosos en organismos tales como Streptomyces, que producen naturalmente policétidos, y E. coli y levaduras, que no producen naturalmente policétidos (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 6.033.883). En los últimos huéspedes, la producción de policétidos es dependiente de la expresión heteróloga de una fosfopanteteinil transferasa, que activa las regiones ACP de PKS (véase la publicación PCT Nº 97/13845).

Aunque dichos procedimientos son valiosos y muy útiles, algunos policétidos se expresan sólo con niveles muy bajos en, o son tóxicos para, la célula huésped heteróloga empleada. Como ejemplo, los agentes anticancerosos epotilonas A, B, C y D se produjeron en Streptomyces mediante la expresión heteróloga de los genes PKS de la epotilona (Tang y col., 28 de Enero de 2000, Clowning and heterologous expression of the epothilone gene cluster, Science, 287: 640-642, y Pub. PCT Nº 00/031247). Las epotilonas A y B se produjeron a menos de aproximadamente 50 a 100 µg/l y parecieron tener un efecto perjudicial sobre las células productoras.

Se identificaron en primer lugar las epotilonas A y B con una actividad antifúngica extraída de la mixobacteria Sorangium cellulosum (véanse Gerth y col., 1996, J. Antibiotics 49: 560-563 y la Patente alemana Nº. DE 4138 042) y posteriormente se encontró que tenían actividad en el ensayo de polimerización de la tubulina (véase Bollag y col., 1995, Cancer Res. 55: 2325-2333). Las epotilonas A y B y algunos derivados que se producen de manera natural y sintética se han estudiado desde entonces extensamente como agentes antitumorales potenciales para el tratamiento del cáncer. Las estructuras químicas producidas por la cepa So ce 90 de Sorangium cellulosum se describieron en Hofle y col., 1996, Epothilone A and B - novel 16-membered macrolides with cytotoxic activity: isolation, crystal structure, and conformation in solution, Angew. Crem. Int. Ed. Engl. 35 (13/14): 1567-1569, Las epotilonas A (R = H) y B (R = CH₃) tienen la estructura que se muestra a continuación y muestran amplia actividad citotóxica contra células eucarióticas y actividad y selectividad evidentes contra las líneas celulares tumorales de mama y colon.

Las contrapartes desoxi de las epotilonas A y B, conocidas también como epotilonas C (R = H) y D (R = CH₃) se han sintetizado químicamente de novo pero están también presentes como productos menores en las fermentaciones de S. cellulosum. Las epotilonas C y D son menos citotóxicas que las epotilonas A y B; a continuación se muestran sus estructuras.

Se ha descrito otras epotilonas que se producen naturalmente. Estas incluyen las epotilonas E y F, en la que la cadena secundaria de metilo del resto tiazol de las epotilonas A y B se ha hidroxilado para dar como resultado las epotilonas E y F, respectivamente, así como otros muchos compuestos de epotilona (véase la Pub. PCT Nº. 99/65913).

Debido al potencial para el uso de las epotilonas como agentes anticancerosos, y debido a los bajos niveles de epotilona producidos por la cepa So ce 90 natural, numerosos equipos de investigación emprendieron el esfuerzo de sintetizar las epotilonas. Tal como se ha señalado anteriormente, este esfuerzo ha sido satisfactorio (véanse Balog y col., 1996, Total synthesis of (-)-epothilone A, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (23/24): 2801-2803; Su y col., 1997, Total synthesis of (-)-epothilone B: an extension of the Suzuki coupling method and insights into structure-activity relationships of the epothilones, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36 (7): 757-759; Meng y col., 1997, Total syntheses of epothilones A and B, JACS 119 (42): 10073-10092; y Balog y col., 1998, A novel aldol condensation with 2-methyl-4-pentenal and its application to an improved total synthesis of epothilone B, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37 (19): 2675-2678). A pesar del éxito de estos esfuerzos, la síntesis química de las epotilonas es tediosa, consume tiempo, y es cara. Por tanto, los procedimientos se han caracterizado como no prácticos para el desarrollo farmacéutico a gran escala de cualquier epotilona como agente anticanceroso.

Se han estudiado in vitro e in vivo numerosos derivados de epotilona, así como las epotilonas A-D (véanse Su y col., 1997, Structure-activity relationships of the epothilones and the first in vivo comparison with paclitaxel, Angew. Chem....

1. Epotilona D cristalina.

2. Procedimiento para obtener epotilona D en forma cristalina que comprende cristalizar epotilona D a partir de un sistema disolvente binario en el que el agua es el disolvente forzador.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el sistema disolvente binario es etanol y agua.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la epotilona D en forma cristalina tiene una pureza superior al 95%.