Una composición que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo,

en la que el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana y el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana, en la que el primer epítopo al que se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al que se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo y en la que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos monoclonales

Ensayos inmunológicos y anticuerpos para Hormona Anti-Mülleriana.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere de forma general a ensayos y métodos inmunológicos para medir compuestos biológicos. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos novedosos para medir la Hormona Anti-Mülleriana (AMH) en una muestra, incluyendo una muestra de mamífero tal como una muestra de ser humano, ratón o rata. En particular, se proporcionan anticuerpos que se unen a la región madura de la Hormona Anti-Mülleriana.

La Hormona Anti-Mülleriana (AMH), también conocida como sustancia inhibidora Mülleriana (MIS), es una hormona glucoproteica dimérica de 140 kilodalton (kDa) que pertenece a la superfamilia del factor de crecimiento transformante β (TGF β), que incluye TGF-β y las diversas glucoproteínas inhibina y activina (Teixeira et al., 2001). Todos los miembros de esta superfamilia son glucoproteínas diméricas y todas están implicadas en la regulación del crecimiento y diferenciación tisular. De forma común con otras proteínas de TGF-β, la AMH se sintetiza como un gran precursor con una corta secuencia señal seguida de la hormona pre-pro que forma homodímeros. Antes de la secreción, la hormona madura se somete a glucosilación y dimerización para producir un dímero de 140 kDa de subunidades monoméricas de 70 kDa unidas por disulfuro idénticas; cada monómero contiene un dominio N-terminal (también denominado la región "pro") y un dominio C-terminal (también denominado la región "madura"). A diferencia de otros miembros de la superfamilia de TGF-β, se piensa que la AMH requiere el dominio N-terminal para potenciar la actividad del dominio C-terminal para conseguir bioactividad completa (Wilson et al., 1993). Después, entre el 5-20% de la AMH se escinde en un sitio específico entre el dominio N-terminal (la región pro) y el dominio C-terminal (la región madura) del monómero de 70 kDa durante el tránsito citoplasmático, para formar dos polipéptidos de 58 kDa (región pro) y 12 kDa (región madura). Estas dos partes del monómero permanecen en unión no covalente. El gen humano que codifica AMH se ha secuenciado y aislado y se localiza en el brazo corto del cromosoma 19 (Picard et al., 1986). También se ha aislado y caracterizado la estructura de un receptor específico para AMH (di Clement et al., 1994; Barrends et al., 1995). Entre especies, la AMH conserva de 11 a 12 restos de cistina conservados, de los cuales siete se localizan en la región madura. Esta región demuestra el mayor grado de homología de secuencia de aminoácidos entre especies, conservándose 108 de los últimos 112 restos entre las secuencias de rata y de ser humano (Lee et al., 1993).

La AMH tiene un papel importante en la diferenciación sexual durante el desarrollo. La AMH se produce por las células de Sertoli del testículo en el hombre y por las células de la granulosa ovárica en la mujer. Durante el desarrollo fetal en hombres, la secreción de AMH de células de Sertoli testiculares es esencial para la regresión de los conductos Mullerianos, y por tanto, el desarrollo normal del tracto reproductor masculino (Picon et al., 1969). Los conductos Mullerianos son el primordio del útero, trompas de Falopio y parte superior de la vagina en la mujer. En el hombre, la secreción de AMH por las células de Sertoli comienza durante la embriogénesis y continúa a lo largo de la vida. Los niveles caen después de la pubertad, disminuyendo lentamente hasta un valor post-puberal relativamente bajo (Teixeira et al., 2001). En la mujer, la AMH sérica se mantiene a niveles relativamente bajos cuando se compara con el hombre. Después de la pubertad, cuando comienza el ciclo menstrual, la AMH circulante disminuye lentamente a lo largo de la vida y se convierte en indetectable en la menopausia. En ratones, la ablación de la función de AMH provoca pérdida aumentada de folículos ováricos y cese prematuro del ciclo ovárico (Durlinger et al., 1999).

Se han identificado varias aplicaciones clínicas para medir la AMH sérica en seres humanos. Entre éstas están el diagnóstico de trastornos de hermafroditismo en niños (Lee et al., 2003), pubertad precoz y aparición retrasada de la pubertad, criptorquidia, anorquidia y evaluación de la función gonadal masculina (Teixeira et al., 2001). Otras aplicaciones potenciales incluyen la investigación de la transición peri-menopáusica en mujeres y la detección y el control de pacientes con cáncer de células de la granulosa (Long et al., 2000). Un trabajo reciente han mostrado que la AMH tiene un potencial como un marcador circulante para la evaluación de la reserva ovárica y fertilidad en mujeres (van Rooij et al., 2002; te Velde et al., 2002; Gruijters et al., 2003). Después de muchos años en los que la AMH se podría describir como un analito esotérico, ahora existe un interés considerable en su potencial como un marcador clínico rutinario.

Prácticamente todos los estudios de investigación de AMH previos se han realizado con uno de dos inmunoensayos. Un ensayo desarrollado por Hudson et al. (Hudson et al., 1990) usa dos anticuerpos monoclonales generados contra AMH recombinante humana, que se dirigen ambos a epítopos en la región pro de la molécula. El uso de este ensayo para medir la AMH en seres humanos desde la infancia hasta la adultez se ha descrito por Lee et al. (1996). Lee et al. (1996) también describen que la AMH es estable cuando se almacena a -20ºC durante hasta 2 años o durante hasta tres ciclos de congelación-descongelación, pero que los valores medidos aumentaron de 2 a 3 veces más allá de 2 años de almacenamiento y disminuyeron el 50% o más después de tres ciclos de congelación-descongelación. Además, Lee et al. (1996) describen que los anticuerpos usados en el ensayo de Hudson no reconocen el fragmento carboxi-terminal (región madura) de AMH y aunque son altamente específicos para AMH humana no procesada de longitud completa (significando no procesada no escindida entre las regiones pro y madura del monómero de 70 kDa), tienen una afinidad mucho menor por el fragmento amino-terminal (región pro) que por la proteína no procesada. Por consiguiente, cierta variabilidad individual en las concentraciones de AMH descrita por Lee et al. (1996) puede deberse a diferencias en el alcance de procesamiento de la proteína de AMH que tiene lugar in vivo. Lee et al. (1996) también describen que los anticuerpos del ensayo de Hudson reconocen AMH de primate no humano así como humana, pero que no reconocen AMH bovina o de roedor. Un segundo ensayo empleado en estudios de investigación de AMH usa un par de anticuerpos monoclonales, uno de los cuales es para un epítopo en la región pro y el otro para un epítopo en la región madura de la AMH humana (Long et al., 2000). Un tercer ensayo descrito más recientemente usa dos anticuerpos monoclonales contra la región pro (Al-Qahtani et al., 2005).

La proteolisis de AMH en muestras medida usando ensayos disponibles actualmente también se ha descrito, de tal forma que se puede requerir una atención particularmente cuidadosa a la recogida y almacenamiento de muestras si se tienen que obtener resultados fiables. La región pro de la AMH se somete a escisión proteolítica durante la incubación en solución (Cate et al., Patente de Estados Unidos 5.359.033). La región madura de AMH es más estable contra proteolisis en comparación con la región pro, en parte debido a sus múltiples restos de cistina.

Los ensayos de AMH previos miden la AMH humana pero no se pueden usar para medir la AMH en muestras de roedor, probablemente debido a que la secuencia de aminoácidos de la región pro varía considerablemente entre especies. La homología de secuencia de aminoácidos global entre las regiones pro en AMH de ratón, rata, ser humano, bovina y de pollo varía entre 37-89% (GenBank, National Centres for Biotechnology Information (NCBI) genetic database). Los ensayos que se pueden usar para medir la AMH en múltiples especies, incluyendo especies de mamífero tales como el ratón y rata así como seres humanos, no han estado disponibles previamente en la técnica. Además de aplicaciones clínicas, tales ensayos tendrían aplicaciones útiles en investigación relacionada con diversas aplicaciones clínicas y otras de las mediciones de AMH....

1. Una composición que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, en la que el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana y el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana, en la que el primer epítopo al que se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al que se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo y en la que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos monoclonales.

2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un soporte sólido unido al primer anticuerpo.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que el soporte sólido comprende una superficie de unión a proteína seleccionada entre el grupo que consiste en una placa de microtitulación, una partícula de metal coloidal, una partícula de óxido de hierro, una partícula de látex y una perla polimérica.

4. La composición de la reivindicación 1, que comprende además el segundo anticuerpo acoplado con un marcador.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que el marcador comprende un agente quimioluminiscente, un agente colorimétrico, un agente de transferencia de energía, una enzima, un agente fluorescente o un radioisótopo.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que la Hormona Anti-Mülleriana comprende una Hormona Anti-Mülleriana de mamífero seleccionada entre el grupo que consiste en una Hormona Anti-Mülleriana de primate, roedor, equina y bovina.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que la Hormona Anti-Mülleriana de primate comprende una Hormona Anti-Mülleriana humana y la Hormona Anti-Mülleriana de roedor comprende una Hormona Anti-Mülleriana de ratón o rata.

8. Un método para medir una cantidad de una Hormona Anti-Mülleriana en una muestra que contiene Hormona Anti-Mülleriana que comprende: