El uso del gen ssrA o un fragmento del mismo constituido al menos por 10 nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de un organismo in vitro procariota o eucariota

Ensayos diagnósticos basados en sondas de ácidos nucleicos para organismos procariotas y eucariotas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la identificación de secuencias diana para su uso en ensayos de ácido nucleico para la detección e identificación de organismos procariotas y eucariotas.

Antecedentes en la técnica

El gen ssrA, que codifica un transcrito de ARN (ARNtm) pequeño, estable de alto número de copias, se encuentra en todas las bacterias y recientemente se ha identificado en cloroplastos y diatomeas. Tiene una doble función como una molécula de ARNt y de ARNm y está implicado en el rescate de los ARNm truncados que han perdido codones de terminación, facilitando la trans-traducción de péptidos truncados antes de la degradación de proteasa (Keiler, K.C. y col. (1996), Science, 271, 990-993). La exclusiva función de los ARNtm ha llevado a los investigadores a analizar la relación de la estructura secundaria de estas moléculas con su función. Estos estudios se han centrado en la conservación de la estructura secundaria de los ARNtm de diferentes microorganismos y en el significado evolutivo y la relevancia funcional de dicha conservación estructural. Los estudios se llevaron a cabo por Matveeva, O y col (1998), vol. 16, Nº. 13, 1374-1375 para investigar la unión de los oligonucleótidos a las moléculas de ARN usando ARNtm como un modelo de ARN que contiene la estructura secundaria. Los estudios también se llevaron a cabo por Williams y col (RNA (1996), 2:1306 - 1310) y Williams et al. (Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26. Nº: 1) en la estructura y función del ARNtm. Los estudios implicaron el alineamiento de las secuencias del gen del ARNtm y el análisis de la homología de secuencia y la estructura secundaria del ARNtm, así como la creación de una base de datos de 37 secuencias de ARNtm para comprender mejor la estructura del ARNtm y los aspectos inusuales de la trans-traducción. Los estudios no tenían como objetivo la identificación de los sitios del ARNtm con el objetivo de diseñar oligonucleótidos antisentido con fines terapéuticos.

El número de dianas/sondas de ácidos nucleicos para diagnósticos bacterianos está actualmente limitado. Como tal, la necesidad de identificar y caracterizar nuevas dianas de ADN y ARN con fines de diagnóstico ahora se ve como una prioridad. Secuencias diana de ácido nucleico para el desarrollo de sondas pueden ser por ejemplo, plásmidos, genes de ARN ribosomal, regiones intergénicas, genes que codifican los factores de virulencia o fragmentos de ADN genómicos aleatorios. Además, se han descrito varias moléculas de ARN que se usan como dianas para la detección basada en ARN por ejemplo, ARN ribosomal y RNasa P.

La base de cualquier ensayo de sondas basado en el ácido nucleico es el requisito para secuencias bien caracterizadas de ácido nucleico que están presentes en todos los procariotas y eucariotas bajo estudio. Para la detección fiable de un organismo procariota o eucariota, las sondas de ácido nucleico usadas deben ser altamente específicas (es decir, no reaccionar en cruzado con ácidos nucleicos de otros organismos) y altamente sensibles (es decir, la mayoría o todas las cepas del organismo a detectar deben reaccionar con la sonda). Por lo tanto, las secuencias diana preferidas estarían presentes en todas las cepas del organismo de que se trate. Estas secuencias tendrían variabilidad significativa de secuencia para permitir la diferenciación de la especie de que se trate de otra estrechamente relacionada con la especie pero, por otra parte, tendría suficiente conservación de secuencia para permitir la detección de todas las cepas de la especie en cuestión. En general, la identificación exacta de una secuencia de ácido nucleico, que podría constituir la base de un ensayo de sonda específico de ácido nucleico, es tediosa, difícil e incierta. Hasta la fecha existen escasas estrategias generales que facilitarían el desarrollo de sondas de ácido nucleico para una amplia diversidad de microorganismos. Las secuencias de ácido nucleico que se han identificado como dianas potencialmente útiles para el desarrollo de sondas son, por ejemplo, los genes de ARNr y la región intergénica 16S/23S del ARNr

La mayoría de los ensayos de sonda/diana de ácido nucleico se centran en el elevado número de copias de los ARN ribosomales (ARNr) y regiones espaciadoras 16S y 23S del ARNr (patente europea Nº: 0 395 292) de la célula bacteriana con fines de detección e identificación. Se han comercializado varios kits de diagnóstico bacteriano de éxito comercial basándose en estas sondas/dianas de ARNr para la detección de una diversidad de microorganismos. Estos incluyen una amplia variedad de kits de sonda comerciales basados en el gen 16S del ARNr comercializados por Genprobe Inc. San Diego California y en sondas de ADN basadas en la región espaciadora 16S/23S comercializados por Innogenetics N.V. Gante, Bélgica. Sin embargo, muchos de estos kits de diagnóstico tienen limitaciones, incluyendo la falta de sensibilidad debido al reducido número de copias de las secuencias diana y a la falta de especificidad debido a la identidad de secuencia entre organismos estrechamente relacionados en muchos casos.

Los procedimientos basados en ácido nucleico que podrían aplicarse directamente a muestras para dar una indicación de la viabilidad de cualquier microbio presente en ella serían de enorme trascendencia para aplicaciones en la alimentación, industriales, ambientales y médicas.

Una desventaja de los procedimientos basados en el ADN, es que no diferencian entre organismos vivos y muertos. Algunos estudios se han centrado sobre el uso del ARNr y ARNm como indicadores de viabilidad celular (Sheridan, G.E.C. y col (1998) Applied and Environmental Microbiology, 64, 1313-1318) Sin embargo, estas secuencias no son dianas satisfactorias ya que el ARNr y el ARNm pueden estar presentes en las células bacterianas hasta 48 horas después de la muerte de las células.

Con la llegada del formato de tipo micromatriz basado en ácido nucleico, que incorpora el control simultáneo de múltiples dianas de ácido nucleico, actualmente existe una clara necesidad para identificar y caracterizar nuevas secuencias de ácido nucleico para su uso como regiones de sondas y/o dianas para detectar e identificar células procariotas y eucariotas viables.

Descripción de la invención

La invención proporciona el uso del gen ssrA o un fragmento del mismo constituido al menos por diez nucleótidos como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para la detección e identificación de un organismo procariota y eucariota.

Por lo tanto, la invención tiene aplicación en relación con todos los organismos distintos a virus.

No se ha descrito ningún otro ensayo de sonda de ácido nucleico que use regiones del gen ssrA como una región diana para detectar e identificar especies de procariotas y eucariotas con las consiguientes ventajas.

De acuerdo con una realización de la invención, como una región diana universal puede usarse un fragmento de la molécula del gen de ssrA correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 5' de la molécula de ADN.

En una realización alternativa de la invención, un fragmento de la molécula de gen de ssrA correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 3' de la molécula de ADN puede usarse como una región diana univer- sal.

En una realización adicional de la invención de un fragmento de la molécula de gen de ssrA correspondiente a una región de baja homología puede usarse como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para diferenciar entre especies.

En otra realización más de la invención un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de baja homología puede usarse como una región diana para la generación de una sonda específica de género.

Como se describe en lo sucesivo en el presente documento las alineaciones de las secuencias de nucleótidos de las secuencias del gen ssrA de diferentes organismos muestran que las regiones 5' y 3' de estas moléculas demuestran un alto grado de homología y por lo tanto, son útiles como regiones diana universales. Los genes ssrA también demuestran un grado más significativo de variabilidad de secuencia de nucleótidos entre organismos estrechamente relacionados que cualquier otro ARN bacteriano de número de copias elevado. Estas regiones variables son dianas ideales en ensayos de ácido nucleico para diferenciar entre especies.

La...

1. El uso del gen ssrA o un fragmento del mismo constituido al menos por 10 nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de un organismo in vitro procariota o eucariota.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de alta homología del extremo 5' de la molécula de ADN se usa como una región diana universal.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de alta homología del extremo 3' de la molécula de ADN se usa como una región diana universal.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para diferenciar entre especies.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana para la generación de una sonda específica de un género.

6. El uso de ARNtm, de un transcrito de ARN del gen ssrA, o de un fragmento del mismo constituido al menos por diez nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de un organismo procariota o eucariota.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología del extremo 5' de la molécula de ARNtm se utiliza como una región diana universal.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología en el extremo 3' de la molécula de ARNtm se utiliza como una región diana universal.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para diferenciar entre especies.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana para la generación de una sonda específica de un género.

11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho fragmento del gen ssrA o dicho fragmento de ARNtm se usa como base de un cebador para usar en un procedimiento de amplificación.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el producto del procedimiento de amplificación se usa como región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda.

13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 - 12, en el que un transcrito de ADNc de una molécula de ARNtm se utiliza como una sonda en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos.

14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa como base de un ensayo para diferenciar organismos procariotas o eucariotas, vivos y muertos.

15. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa en un formato de sondas múltiples para la detección y/o identificación a gran escala de organismos procariotas o eucariotas.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que una sonda del gen ssrA o una sonda de un transcrito de ARNtm está unida a un sistema de microplaca de genes de micromatriz para la detección e identificación a gran escala a alto rendimiento de organismos procariotas o eucariotas.

17. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa como una sonda en un ensayo para detectar organismos procariotas o eucariotas en una muestra de materia.

18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que un fragmento del gen ssrA o del transcrito de ARNtm se usa en un ensayo para obtener un perfil de ADN de un sistema procariota o eucariota y, por lo tanto, diferenciar entre cepas de la misma especie.

19. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que gen ssrA, el transcrito de ARNtm o una secuencia de ADN complementaria de este, o un fragmento del mismo, se usa para diseñar un agente dirigido contra organismos infecciosos procariotas o eucariotas para propósitos terapéuticos.

20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la región diana se usa para controlar la eficacia de las terapias con fármacos contra agentes infecciosos.

21. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la región diana se usa para controlar la viabilidad y el nivel de organismos beneficiosos para la salud en el tracto gastrointestinal.

22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el ensayo se usa para la cuantificación de organismos procariotas o eucariotas.

23. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 11-13, en el que, para identificar un organismo procariota o eucariota, se usa una base de datos de las secuencias del gen ssrA.