ENSAYO MULTIPLEX DE DETECCIÓN DE ORGANISMOS PATOGÉNICOS.

Método para la identificación de un organismo patogénico a partir de un grupo predeterminado de patógenos,

que comprende: a) purificar por lo menos parcialmente un ácido nucleico a partir de una muestra clínica, b) someter por lo menos una primera alícuota de dicho espécimen clínico a por lo menos una reacción de amplificación y detección en un recipiente de reacción, que comprende: ba) una etapa de amplificación utilizando un primer conjunto de cebadores de amplificación capaz de amplificar una región espaciador preseleccionada 16s/23s ó 18s/26s de entre varios o todos los miembros de dicho grupo predeterminado de patógenos, bb) una etapa de detección utilizando por lo menos 2, 3 ó múltiples reactivos de hibridación, siendo dichos reactivos capaces conjuntamente de detectar específicamente una región espaciadora preseleccionada 16s/23s ó 18s/26s de entre todos los miembros de dicho grupo de patógenos, comprendiendo dicha etapa de detección bb) las etapas: bba) seguimiento de la hibridación de cada uno de dichos reactivos de hibridación a una temperatura preseleccionada, siendo indicativa dicha hibridación de por lo menos el género de dicho patógeno presente en la muestra, y bbb) seguimiento de la dependencia de la temperatura que presenta la hibridación con dichos reactivos de hibridación, y determinación de la temperatura de fusión, siendo indicativa dicha dependencia de la temperatura de por lo menos la especie de dicho patógeno. c) Determinar si se produce una señal de hibridación en la etapa bba), si se encuentra presente un organismo patogénico de un género determinado en dicha muestra, y determinar a partir de la dependencia de la temperatura de la etapa bbb), qué especie patogénica de dicho género se encuentra presente en dicha muestra

La invención se refiere al campo técnico de la detección de organismos microbianos patogénicos. Más

ácidos nucleicos de dicho organismo patogénico. Antecedentes de la técnica

La infección por bacterias patogénicas, particularmente en el caso de que provoquen sepsis, ocurre predominantemente y en forma grave en unidades de cuidados intensivos (UCI) de hospitales. La bacteria que infecta al paciente es, en la mayoría de casos, desconocida y no puede determinarse a partir de los síntomas. Cada bacteria requiere una terapia diferente utilizando la administración de un antibiótico específico. En la actualidad, en el diagnóstico rutinario, las bacterias patogénicas, particularmente las bacterias Gram-positivas, se detectan utilizando un método que incluye someter una muestra de sangre o de otro líquido corporal al cultivo de la bacteria, en caso de encontrarse presente. Este cultivo se mantiene bajo condiciones que favorecen el crecimiento bacteriano durante aproximadamente tres días. Durante este tiempo, se incrementa el número de bacterias y de esta manera de sus ácidos nucleicos. A continuación, se somete a lisis el medio de cultivo. La mezcla de lisis se utiliza como la muestra para los análisis bioquímicos o

inmunológicos posteriores. El método general requiere como mínimo aproximadamente cuatro días hasta alcanzar una conclusión clara respecto a cualquier infección de la muestra por parte de bacterias patogénicas. La infección por

administración de un antibiótico adecuado para afectar específicamente a la bacteria infecciosa particular. De lo contrario, la persona resultará excesivamente afectada por la infección y podría morir antes de alcanzar una conclusión sobre la infección. Por otra parte, la administración de varios antibióticos de amplio rango simultáneamente para prevenir sucesos sistémicos debe evitarse para no debilitar al paciente. De esta manera, los actuales métodos no resultan satisfactorios para el diagnóstico rutinario en la UCI.

La identificación de organismos patogénicos, tales como bacterias patogénicas u hongos por medio de la hibridación basada en ácidos nucleicos utilizando sondas de hibridación específicas ha sido conocida de la técnica desde hace mucho tiempo. Por ejemplo, la patente EP nº 0 131 052 da a conocer métodos y sondas en las que se detectan secuencias de ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) de una especie determinada o de un grupo determinado de organismos directamente a partir del medio de cultivo. La detección de secuencias diana ribosómicas resulta especialmente útil debido al hecho de que estas secuencias se amplifican in vivo, resultando en

una sensibilidad elevada del ensayo respectivo.

Se consiguió una mejora de la detección basada en la secuencia de ácidos nucleicos de los organismos patogénicos con la disponibilidad de la tecnología de PCR. Para la detección de hongos patogénicos, tales como Candida y Aspergillus, por ejemplo, la patente WO nº 97/07238 da a conocer un método que utiliza cebadores genéricos para amplificar todos los tipos de secuencia de ADNr 18S ribosómico y la hibridación posterior con sondas específicas de especies fúngicas.

A modo de alternativa al análisis de secuencias génicas ribosómicas, se han utilizado secuencias de ADN espaciador ribosómicas no codificantes pero transcritas, tales como la región ITS-1 situada entre los genes de ARNr 16S y 23S, para la detección e identificación de algunos organismos patogénicos (ver, por ejemplo, la patente EP nº 0 452 596).

En otro contexto, los grupos de bacterias Grampositivas y Gram-negativas han sido discriminadas por medio de una amplificación dependiente de diana comparable a un enfoque de amplificación específica de alelo (Klausegger A. et al., J. Clin. Microbiol. 37:464-466, 1999). Basándose en sus secuencias de ADNr 16S, las especies investigadas por Klausegger et al. difieren en una posición dada del gen de ARNr 16S en que todas las bacterias Gram-negativas investigadas contienen un residuo G en una posición nucleotídica determinada, mientras que todas las bacterias Gram-positivas investigadas siempre contienen un residuo C en dicha posición nucleotídica. En consecuencia, la utilización de cebadores apropiados que presentan un residuo

de C 3'-terminal complementario discriminante o un residuo G

complementario, respectivamente, resulta en la amplificación de ADN de origen de secuencia Gram-positivo o Gram-negativo.

Se han realizado avances adicionales con la disponibilidad de la PCR en tiempo real cinética. En este tipo de ensayo, se realiza un seguimiento de la formación de productos de PCR en cada ciclo de la PCR. La amplificación habitualmente se mide en termocicladores que presentan un medio de detección adicional para el seguimiento de señales de fluorescencia durante la reacción de amplificación. Un ejemplo típico es el Roche Diagnostics LightCyclerTM (nº de cat. 2 0110468). En el LightCyclerTM , así como en otros instrumentos de PCR en tiempo real disponibles comercialmente hasta el momento, los productos de amplificación se detectan por medio de sondas de hibridación marcadas fluorescentemente que únicamente emiten señales de fluorescencia cuando se encuentran unidas al ácido nucleico diana o en determinados casos también por medio de pigmentos fluorescentes que se unen a ADN de doble cadena. Se determina un umbral de señal definido para todas las reacciones que deben analizarse y se determina el número de ciclos (Cp) requerido para alcanzar este valor umbral para el ácido nucleico diana, así como para los ácidos nucleicos de referencia, tales como un gen estándar o un gen de mantenimiento. Pueden determinarse los números de copia absolutos o relativos de la molécula diana basándose en los valores de Cp obtenidos para el ácido nucleico diana y para el ácido nucleico de referencia (manual de operador de Roche Diagnostics LightCyclerTM (nº de cat. 2 0110468)).

Existen formatos diferentes para la detección de ADN amplificado:

a) formado de pigmento de unión a ADN

Debido a que la cantidad de producto de amplificación de doble cadena habitualmente excede la cantidad de ácido nucleico presente originalmente en la muestra que debe analizarse, pueden utilizarse pigmentos específicos de ADN de doble cadena, que tras excitarse con una longitud de onda apropiada muestran fluorescencia incrementada únicamente en el caso de que se encuentren unidos a ADN de doble cadena. Este tipo de método se describe en la patente EP nº 0 512

334. Preferentemente únicamente se utilizan aquellos pigmentos, tales como, por ejemplo, verde SYBR® I, que no afectan a la eficiencia de la reacción de PCR.

Todos los demás formatos conocidos de la técnica requieren el diseño apropiado de una sonda de hibridación marcada fluorescentemente que únicamente emita fluorescencia tras la unión a su ácido nucleico diana.

b) Sondas TaqManTM

Se marca con dos componentes una sonda de hibridación de una cadena. Al excitarse el primer componente, denominado fluorescente, con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere al segundo componente, el denominado inhibidor, según el principio de transferencia de energía fluorescente resonante. Durante la etapa de hibridación de la reacción de PCR, la sonda de hibridación se une al ADN diana y resulta degradada por la actividad 5' a 3' exonucleasa de la polimerasa, por ejemplo la polimerasa

Taq, durante la etapa de alargamiento. Como resultado, el

componente fluorescente excitado y el inhibidor se encuentran separados espacialmente entre sí y, de esta manera, puede medirse una emisión de fluorescencia del primer componente (patente EP nº 0 543 942 y patente US nº 5.210.015).

c) Balizas moleculares

Estas sondas de hibridación también se marcan con un primer componente y con un inhibidor, estando situados los marcajes preferentemente en diferentes extremos de una sonda por lo menos parcialmente autocomplementaria. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes se encuentran...

1. Método para la identificación de un organismo patogénico a partir de un grupo predeterminado de patógenos, que comprende: a) purificar por lo menos parcialmente un ácido nucleico a partir de una muestra clínica, b) someter por lo menos una primera alícuota de dicho espécimen clínico a por lo menos una reacción de amplificación y detección en un recipiente de reacción, que comprende:

ba) una etapa de amplificación utilizando un primer conjunto de cebadores de amplificación capaz de amplificar una región espaciador preseleccionada 16s/23s ó 18s/26s de entre varios

o todos los miembros de dicho grupo predeterminado de patógenos, bb) una etapa de detección utilizando por lo menos 2, 3 ó múltiples reactivos de hibridación, siendo dichos reactivos capaces conjuntamente de detectar específicamente una región espaciadora preseleccionada 16s/23s ó 18s/26s de entre todos los miembros de dicho grupo de patógenos, comprendiendo dicha etapa de detección bb) las etapas:

bba) seguimiento de la hibridación de cada uno de dichos reactivos de hibridación a una temperatura preseleccionada, siendo indicativa dicha hibridación de por lo menos el género de

dicho patógeno presente en la muestra, y

bbb) seguimiento de la dependencia de la temperatura que presenta la hibridación con dichos reactivos de hibridación, y determinación de la temperatura de fusión, siendo indicativa dicha dependencia de la temperatura de por lo menos la especie de dicho patógeno.

c) Determinar si se produce una señal de hibridación en la etapa bba), si se encuentra presente un organismo patogénico de un género determinado en dicha muestra, y determinar a partir de la dependencia de la temperatura de la etapa bbb), qué especie patogénica de dicho género se encuentra presente en dicha muestra.

2. Método según la reivindicación 1, en el que una primera y una segunda alícuotas se someten, cada una, a una reacción de amplificación y detección independientemente entre sí en dos recipientes de reacción diferentes.

3. Método según la reivindicación 2, en el que una primera, segunda y tercera alícuotas se someten, cada una, a una reacción de amplificación y de detección independientemente entre sí en dos recipientes de reacción diferentes.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que se utiliza un reactivo de hibridación adicional para la detección de un control interno.

5. Método según la reivindicación 2, en el que se identifican exclusivamente organismos patogénicos Grampositivos en una reacción de amplificación y detección

y se identifican exclusivamente organismos Gramnegativos patogénicos en otra reacción de amplificación y detección.

6. Método según las reivindicaciones 3 y 5, en el que se

5 identifican exclusivamente patógenos fúngicos en la tercera reacción de amplificación y detección.

7. Método según las reivindicaciones 2 a 6, en el que cada etapa de amplificación se lleva a cabo con el mismo perfil de termociclado. --