Una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende:

(a)una partícula similar a virus; y

(b)una sustancia inmunoestimuladora;

en la que dicha sustancia inmunoestimuladora se empaqueta en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado

Empaquetamiento de CpG inmunoestimuladores en partículas similares a virus: método de preparación y uso.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la vacunología, inmunología y medicina: La invención proporciona composiciones y métodos para potenciar las respuestas inmunológicas frente a partículas similares a virus (VLP) o frente a antígenos acoplados, fusionados o unidos de otro modo a VLP por empaquetamiento de sustancias inmunoestimuladoras, oligonucleótidos que contienen al menos una secuencia CpG no metilada, en las VLP. La invención puede usarse para inducir respuestas de células T potentes y mantenidas, particularmente útiles para el tratamiento de tumores y enfermedades víricas crónicas, así como de alergias y otras enfermedades crónicas.

La esencia del sistema inmune se basa en dos pilares de cimentación separados: uno es la inmunidad específica o adaptativa, que se caracteriza por una cinética de respuesta relativamente lenta y por la capacidad de memoria, la otra es la inmunidad inespecífica o innata, que presenta una cinética de respuesta rápida pero carece de memoria. Los linfocitos son los elementos clave del sistema inmune adaptativo. Cada linfocito expresa receptores de antígenos de especificidad única. Tras el reconocimiento de un antígeno por el receptor, los linfocitos proliferan y desarrollan una función efectora. Pocos linfocitos presentan especificidad por un antígeno o patógeno dado, y habitualmente es necesaria una proliferación masiva antes de que pueda medirse una respuesta efectora -de ahí la cinética lenta del sistema inmune adaptativo. Puesto que una proporción significativa de los linfocitos expandidos sobrevive y puede mantener cierta función efectora después de la eliminación del antígeno, el sistema inmune adaptativo reacciona más rápido cuando se encuentra con el antígeno por segunda vez. Esta es la base de su capacidad de memoria.

Al contrario de lo que ocurre con los linfocitos, en los que la especificidad por un patógeno se limita a unas pocas células que deben expandirse para adquirir una función, las células y moléculas del sistema inmune innato están habitualmente presentes en cantidades masivas y reconocen un número limitado de características invariantes asociadas con patógenos (Medzhitov, R. y Janeway, C. A., Jr., Cell 91: 295-298 (1997)). Los ejemplos de dichos patrones incluyen lipopolisacáridos (LPS), ADN rico en CG no metilado (CpG) o ARN bicatenario, que son específicos de infecciones bacterianas y víricas, respectivamente.

La mayor parte de la investigación en inmunología se ha centrado en el sistema inmune adaptativo y sólo recientemente el sistema inmune innato se ha convertido en el centro de interés. Históricamente, el sistema inmune adaptativo e innato se trataron y analizaron como dos entidades separadas que tenían poco en común. Tal era la disparidad que pocos investigadores se preguntaban por qué los antígenos eran mucho más inmunogénicos para el sistema inmune específico cuando se aplicaban con adyuvantes que estimulasen la inmunidad innata (Sotomayor, E. M., et al., Nat. Med. 5: 780 (1999); Diehl, L, et al., Nat. Med. 5: 774 (1999); Weigle, W. O., Adv. Immunol. 30: 159 (1980)). Sin embargo, la respuesta planteada por esta cuestión es crítica para el entendimiento del sistema inmune y para la comprensión del equilibrio entre inmunidad protectora y autoinmunidad.

Una manipulación racionalizada del sistema inmune innato y, en particular, de la activación de APC implicadas en la sensibilización de células T, para inducir deliberadamente una respuesta de células T autoespecífica proporciona un medio para terapia tumoral basada en células T. Por consiguiente, la mayoría de las terapias actuales se centran en el uso de células dendríticas activadas (DC) como portadores de antígenos para la inducción de respuestas de células T mantenidas (Nestle et al. Nat. Med. 4: 328 (1998)). De forma similar, se aplican activadores del sistema inmune innato in vivo, tales como CpG o anticuerpos anti-CD40 junto con células tumorales para potenciar su inmunogenicidad (Sotomayor, E. M., et al., Nat. Med. 5: 780 (1999); Diehl, L., et al., Nat. Med. 5: 774 (1999)).

Con frecuencia la activación generalizada de APC por factores que estimulen la inmunidad innata puede ser la causa del desencademaniento de linfocitos autoespecíficos y autoinmunidad. La activación puede dar como resultado una expresión aumentada de moléculas coestimuladoras o citocinas tales como IL-12 o IFNa. Este punto de vista es compatible con la observación de que la administración de LPS junto con extractos de tiroides es capaz de superar la tolerancia y desencadenar una tiroiditis autoinmune (Weigle, W. O., Adv. Immunol. 30: 159 (1980)). Además, en un modelo de ratón transgénico se ha demostrado recientemente que la administración de un péptido propio en solitario no causaba autoinmunidad a menos que se activaran las APC por una ruta separada (Garza, K. M., et al., J. Exp. Med. 191: 2021 (2000)). El vínculo entre la inmunidad innata y las enfermedades autoinmunes se subraya adicionalmente por la observación de que la activación de APC por LPS, infecciones víricas o generalizada retrasa o impide el establecimiento de una tolerancia periférica (Vella, A. T., et al., Immunity 2: 261 (1995); Ehl, S., et al., J. Exp. Med. 187: 763 (1998); Maxwell, J. R., et al., J. Immunol. 162: 2024 (1999)). De este modo, la inmunidad innata no sólo potencia la activación de linfocitos autoespecíficos, sino también inhibe su posterior eliminación. Estos descubrimientos pueden extenderse a la biología de tumores y al control de enfermedades víricas crónicas.

La inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) después de la inmunización con antígenos menores de histocompatibilidad, tales como el antígeno HY, requiere la presencia de células T auxiliares (células Th) (Husmann, L. A., y J. M. Bevan, Ann. NY. Acad. Sci. 532: 158 (1988); Guerder, S., y P. Matzinger, J. Exp. Med. 176: 553 (1992)). También se ha demostrado que las respuestas de CTL inducidas por sensibilización cruzada, es decir, por sensibilización con antígenos exógenos que alcanzaron la ruta de clase I, requieren la presencia de células Th (Bennett, S. R. M., et al., J. Exp. Med. 186: 65 (1997)). Estas observaciones tienen consecuencias importantes para la terapia de tumores en la que las células T auxiliares pueden ser críticas para la inducción de respuestas de CTL protectoras por células tumorales (Ossendorp, F., et al., J. Exp. Med. 187: 693 (1998)).

Una molécula efectora importante en células Th activadas es el ligando CD40 (CD40L) que interacciona con CD40 en células B, macrófagos y células dendríticas (DC) (Foy, T. M., et al., Annu. Rev. Immunol. 14: 591 (1996)). El desencadenamiento de CD40 en células B es esencial para el cambio de isotipo y la generación de una memoria de células B (Foy, T. M., et al., Ann. Rev. Immunol. 14: 591 (1996)). Más recientemente, se demostró que la estimulación de CD40 en macrófagos y DC conduce a su activación y maduración (Cella, M., et al., Curr. Opin. Immunol. 9: 10 (1997); Banchereau, J., y R. M. Steinman Nature 392: 245 (1998)). En concreto, las DC regulan positivamente moléculas coestimuladoras y producen citocinas tales como IL-12 tras su activación. Curiosamente, esta maduración mediada por CD40L de DC parece ser responsable del efecto auxiliar en las respuestas de CTL. De hecho, se ha demostrado recientemente que el desencadenamiento de CD40 por células Th vuelve a las DC capaces de iniciar una respuesta de CTL (Ridge, J. P., et al., Nature 393: 474 (1998); Bennett, S. R. M., et al., Nature 393: 478 (1998); Schoenenberger, S. P., et al., Nature 393: 480 (1998)). Esto concuerda con la observación anterior de que las células Th tienen que reconocer sus ligandos en las mismas APC que los CTL, indicado que es necesaria una interacción afín (Bennett, S. R. M., et al., J. Exp. Med. 186: 65 (1997)). Por lo tanto, la estimulación mediada por CD40L por células Th conduce a la activación de DC que, posteriormente, son capaces de estimular respuestas de CTL. En el ser humano, los interferones tipo I, en particular los interferones a y ß, pueden ser igual de importantes que IL-12.

Al contrario que estas respuestas de CTL dependientes de Th, los virus son capaces con frecuencia de inducir respuestas de CTL protectoras en ausencia de células T auxiliares (para una...

1. Una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende:

en la que dicha sustancia inmunoestimuladora se empaqueta en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

2. La composición de la reivindicación 1 que comprende además al menos un antígeno, en la que dicho antígeno está unido a dicha partícula similar a virus.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus es una partícula similar a virus recombinante.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes seleccionadas del grupo que consiste en:

5. La composición de la reivindicación 4, en la que dicha partícula similar a virus es la proteína de núcleo del virus de la Hepatitis B o la proteína VP1 del virus BK.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en:

8. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho fago de ARN es bacteriófago Qß.

9. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho fago de ARN es bacteriófago AP205.

10. La composición de la reivindicación 1, en la dicha partícula similar a virus es una partícula similar a virus de un fago de ARN.

11. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende la secuencia:

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3'

en la que X₁, X₂, X₃ y X₄ son cualquier nucleótido.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que al menos uno de dichos nucleótidos X₁, X₂, X₃ y X₄ tiene una modificación de la cadena principal fosfato.

13. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende, o como alternativa consiste esencialmente en o como alternativa consiste en la secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

14. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en la secuencia GGGGGGGGGG GACGATCGTCGGGGGGGGGG.

15. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado es palindrómico.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado palindrómico comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en la secuencia GGGGTCAACGTTGAGGGGG.

17. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado contiene una o más modificaciones fosforotioato de la cadena principal fosfato o en la que cada resto fosfata de dicha cadena principal fosfato de dicho oligonucleótido es una modificación de fosforotioato.

18. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado comprende de aproximadamente 6 a aproximadamente 300 nucleótidos.

19. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula similar a virus por al menos un enlace covalente no peptídico.

20. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está fusionado a dicha partícula similar a virus.

21. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en:

22. La composición de la reivindicación 21, en la que dicho antígeno es una molécula orgánica y en la que dicha molécula orgánica se selecciona del grupo que consiste en:

23. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno procede del grupo que cosiste en:

24. La composición de la reivindicación 23, en la que dicho antígeno es un antígeno tumoral.

25. La composición de la reivindicación 24, en la que dicho antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en:

26. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno se une a dicha partícula similar a virus por medio de una secuencia de enlace.

27. La composición de la reivindicación 2, en la que dicho antígeno es un epítopo de célula T citotóxica, un epítopo de célula Th o una combinación de al menos dos de dichos epítopos, en la que dichos al menos dos epítopos se unen directamente o por medio de una secuencia de enlace y en la que dicho epítopo de célula T citotóxica es un epítopo de célula T citotóxica viral o tumoral.

28. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

29. Una composición que comprende:

en la que dicha sustancia inmunoestimuladora está empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado; para el uso en un método para potenciar una respuesta inmune en un animal que comprende introducir dicha composición en dicho animal.

30. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicha composición se define como en cualquiera de las reivindicaciones 2-28.

31. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicha respuesta inmune es una respuesta de células B potenciada o una respuesta de células T potenciada.

32. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 31, en la que dicha respuesta de células T es una respuesta de CTL o una respuesta de células Th.

33. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 32, en la que dicha respuesta de células Th es una respuesta de células Th1.

34. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicho animal es un mamífero.

35. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 34, en la que dicho mamífero es un ser humano.

36. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en la que dicha composición se introduce en dicho animal por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o directamente en el ganglio linfático.

37. Uso de una composición que comprende:

en la que dicha sustancia inmunoestimuladora está empaquetada en dicha partícula similar a virus y en la que dicha sustancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado;

para la fabricación de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, en el que dicha composición se va a introducir en dicho animal.

38. El uso de la reivindicación 37, en el que dicha composición se define como en cualquiera de la reivindicaciones 2-28.

39. El uso de la reivindicación 37, en el que dicha respuesta inmune es una respuesta de células B potenciada o una respuesta de células T potenciada.

40. El uso de la reivindicación 39, en el que dicha respuesta de células T es una respuesta de CTL o una respuesta de células Th.

41. El uso de la reivindicación 40, en el que dicha respuesta de células Th es una respuesta de células Th1.

42. El uso de la reivindicación 37, en el que dicho animal es un mamífero.

43. El uso de la reivindicación 42, en el que dicho mamífero es un ser humano.

44. El uso de la reivindicación 37, en el que dicha composición se introduce en dicho animal por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o directamente en el ganglio linfático.

45. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

comprendiendo dicho método:

46. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

comprendiendo dicho método:

47. El método de la reivindicación 45 ó 46, en el que dicha partícula similar a virus se produce en un sistema de expresión bacteriano.

48. El método de la reivindicación 45 ó 46, en el que dicha ARNasa es ARNasa A.

49. El método de la reivindicación 45 ó 46, en el que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

50. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

comprendiendo dicho método:

51. El método de la reivindicación 50, que comprende además eliminar los ácidos nucleicos de dicha partícula similar a virus desensamblada.

52. El método de la reivindicación 50, que comprende además purificar dicha composición después del reensamblaje (c).

53. El método de la reivindicación 50, en el que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

54. Un método de producción de una composición para potenciar una respuesta inmune en un animal, comprendiendo dicha composición:

comprendiendo dicho método:

55. El método de la reivindicación 54, en el que dichos iones metálicos se seleccionan del grupo que consiste en:

56. El método de la reivindicación 54, en el que dicho oligonucleótido que contiene CpG no metilado no está accesible para la hidrólisis por ADNasa.

57. Una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de la reivindicación 1 ó 2 o cualquiera de las reivindicaciones 3-28 junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

58. La vacuna de la reivindicación 57, en la que dicha vacuna comprende además un adyuvante.

59. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna de acuerdo con la reivindicación 57 para usar en un método de inmunización o tratamiento de un animal que comprende administrar dicha cantidad a dicho animal.

60. La vacuna para el uso de la reivindicación 59, en la que dicho animal es un mamífero.

61. La vacuna para el uso de la reivindicación 60, en la que dicho mamífero es un ser humano.

62. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna de la reivindicación 57 para el uso en un método de inmunización o tratamiento de un animal que comprende estimular una respuesta de células T en dicho animal por administración de dicha cantidad.

63. La vacuna para el uso de la reivindicación 62, que comprende además la etapa de reforzar la respuesta inmune en dicho animal, en la que dicho refuerzo se efectúa por administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna de la reivindicación 57 o una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna heteróloga.

64. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la vacuna de la reivindicación 57 para usar en un método de inmunización o tratamiento de un animal que comprende reforzar una respuesta de células T en dicho animal por administración de dicha cantidad.

65. La vacuna para el uso de la reivindicación 64, que comprende además la etapa de estimular una respuesta de células T en dicho animal, en la que dicha estimulación se efectúa por administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna de la reivindicación 57 o una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna heteróloga.

66. La vacuna para el uso de la reivindicación 63 o de la reivindicación 65, en la que dicha vacuna comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de la reivindicación 1 junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y en la que dicha vacuna heteróloga es una vacuna de ADN.

67. La vacuna para el uso de la reivindicación 63 o de la reivindicación 65, en la que dicha vacuna comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de la reivindicación 2 junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y en la que dicha vacuna heteróloga es una vacuna de ADN o una vacuna viral o una vacuna de la viruela del canario.