PROCESO DE FERMANTACIÓN ESCALABLE.

Proceso para la expresión de una proteína de la cápside recombinante de un bacteriófago o un mutante o fragmento de la misma capaz de formar una VLP mediante auto-ensamblaje,

en donde dicho bacteriófago es un bacteriófago de ARN, y en donde dicho proceso comprende los pasos de: a.) introducir un plásmido de expresión en un huésped bacteriano, en donde dicho plásmido de expresión comprende un constructo de expresión, en donde dicho constructo de expresión comprende (i) una primera secuencia de nucleótido que codifica dicha proteína de la cápside recombinante, o mutante o fragmento de la misma, y (ii) un promotor que es inducible por lactosa; b) cultivar dicho huésped bacteriano en un medio que comprende una fuente de carbono principal; en donde dicha fuente de carbono principal es glucosa o glicerol; y en donde dicho cultivo se realiza en cultivo discontinuo y en condiciones bajo las cuales dicho promotor se reprime por lacl, en donde dicho lacl es sobreexpresado por dicho huésped bacteriano; c) alimentar dicho cultivo discontinuo con dicha fuente de carbono principal; y d) inducir dicho promotor con un inductor, en donde se continúa dicha alimentación de dicho cultivo discontinuo con dicha fuente de carbono principal.

Proceso de fermentación escalable Campo de la invención La presente invención hace referencia al campo de la tecnología de expresión de proteínas y fermentación. Se describe un proceso para la expresión eficiente de proteína de la cápside de bacteriófago de ARN recombinante en el huésped bacteriano. El proceso lleva a un alto rendimiento de proteína de la cápside recombinante que es capaz de formar partículas similares a virus (VLP, por sus siglas en inglés) por auto-ensamblaje. Además, el proceso puede extenderse de la escala de laboratorio a volúmenes de fermentador superiores a 50 litros.

Antecedentes de la invención Estrategias de vacunación recientes utilizan virus o partículas similares a virus (VLP) para mejorar la respuesta inmune hacia los antígenos. Por ejemplo, la patente WO02/056905 demuestra la utilidad de las VLP como portadoras para presentar antígenos asociados a éstas en una matriz repetitiva sumamente ordenada. Tales matrices de antígenos pueden causar una respuesta inmune potente, en particular respuestas de anticuerpos, contra el antígeno asociado e incluso son capaces de romper la tolerancia inherente del sistema inmune hacia los autoantígenos. Por lo tanto, tales matrices de antígenos son útiles en la producción de vacunas para el tratamiento de enfermedades infecciosas y alergias y para la inducción eficiente de las respuestas inmunes auto-específicas, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer, artritis reumatoide y otras enfermedades.

Como se indica en la patente WO02/056905 las proteínas de la cápside de bacteriófagos son particularmente adecuadas como portadores de antígenos. Se ha demostrado que se auto-ensamblan de manera eficiente en VLPs ante la expresión en un huésped bacteriano (Kastelein et al. 1983, Gene 23:245-254; Kozlovskaya et al. 1986, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455) . Además, las proteínas de la cápside de bacteriófagos tales como los derivados de fr (Pushko et al. 1993, Protein Engineering 6 (8) 883-891) , Qβ (Kozlovska et al. 1993, Gene 137: 133-137; Ciliens et al. 2000, FEBS Letters 24171:1-4; Vasiljeva et al 1998, FEBS Letters 431:7-11; Kozlovska et al., 1996, Intervirology 39=9-15) y MS-2 (WO92/13081 Mastico et al. 1993, Journal of General Virology 74:541-548; Hcal ct al. 2000, Vaccine 18:251-258) se han producido en huéspedes bacterianos utilizando promotores inducibles tales como el promotor trp o una fusión de trp-T7 (en el caso de fr y Qb) o el promotor tac utilizando IPTG como sustancia inductora (en el caso de MS-2) . La utilización de promotores inducibles es beneficiosa, para evitar posibles efectos tóxicos de la proteína de la cápside recombinante y la carga metabólica de la expresión de proteína que podrían ambos reducir el crecimiento del huésped de expresión bacteriana y, finalmente, el rendimiento de la proteína expresada.

Sin embargo, los sistemas de expresión utilizados hasta el momento para la expresión de proteínas de la cápside de bacteriófagos se han aplicado en fermentaciones de pequeña escala, es decir, en escala de laboratorio y pequeños cultivos discontinuos con volúmenes normalmente menores a 1 litro. Se espera que un aumento de escala de estos sistemas que comprenden volúmenes de 50 litros y más disminuya en gran medida el rendimiento de la proteína de la cápside respectiva debido a una pérdida del promotor y/o menor retención de plásmido.

Otro problema asociado con la expresión de alto nivel comercialmente deseada y rápida acumulación de proteínas de la cápside recombinantes de bacteriófagos es la formación de especies de proteína plegadas incorrectamente y la formación de los llamados cuerpos de inclusión, es decir, agregados de proteínas, que son insolubles y que pueden perjudicar otros procesos subsiguientes. Por lo tanto, para la proteína de la envoltura de bacteriófago MS-2 se ha informado sobre la formación de agregados de proteínas y de especies de proteínas que perdieron su capacidad de ensamblaje scif a VLP cuando la proteína se expresaba bajo el control del promotor T7 potente después de la inducción con IPTG utilizando el sistema de expresión pET (Peabody & Al-Bitar 2001, Nucleic Acid Research 29 (22) :e113) .

Por lo tanto, las altas tasas de expresión de la proteína de la cápside recombinante pueden tener un impacto negativo sobre el rendimiento de las VLP ensambladas correctamente. La producción de vacunas basadas en VLPs en una escala comercial requiere, por lo tanto, el establecimiento de un proceso de fermentación eficiente y en particular escalable para la expresión de la proteína de la cápside recombinante de los bacteriófagos que llevan a un producto de calidad y pureza constantes que tiene la capacidad de auto-ensamblaje en VLPs, de este modo se minimiza o evita la formación de fracciones insolubles de la proteína de la cápside.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso para la expresión de una proteína de la cápside recombinante de un bacteriófago de ARN que evita o minimiza la desventaja o desventajas de los procesos del arte previo, y en particular, que es escalable a una escala comercial y que aún así lleva a un producto de calidad y pureza constantes y la capacidad de auto-ensamblaje a VLPs, y en donde se minimiza o evita la formación de fracción insoluble de la proteína de la cápside.

Resumen de la invención La invención hace referencia a un proceso de expresión de una proteína de la cápside recombinante de un bacteriófago, o un mutante o fragmento de la misma capaz de formar un VLP mediante auto-ensamblaje, en donde dicho bacteriófago es un bacteriófago de ARN, y en donde dicho proceso comprende los pasos de a) introducir un plásmido de expresión en un huésped bacteriano, en donde dicho plásmido de expresión comprende un constructo de expresión, en donde dicho constructo de expresión comprende (i) una primera secuencia de nucleótido que codifica dicha proteína de la cápside recombinante, o mutante o fragmento de la misma, y (ii) un promotor que es inducible por lactosa; b) cultivar dicho huésped bacteriano en un medio que comprende una fuente de carbono principal en donde dicha fuente de carbono principal es glucosa o glicerol, y en donde dicho cultivo se realiza en cultivo discontinuo y en condiciones bajo las cuales dicho promotor se reprime por lacl, en donde dicho lacl es sobreexpresado por dicho huésped bacteriano; c) alimentar dicho cultivo discontinuo con dicha fuente de carbono principal; y d) inducir dicho promotor con un inductor, en donde se continúa dicha alimentación de dicho cultivo discontinuo con dicha fuente de carbono principal.

Esta invención proporciona un proceso de fermentación sólido para la expresión de una proteína de la cápside de un bacteriófago de ARN que forma un VLP por auto-ensamblaje, en donde el proceso es escalable a una escala de producción comercial y en donde la tasa de expresión de la proteína de la cápside lleva a un rendimiento mejorado de la proteína de la cápside soluble. Esto se logra, en particular, mediante la represión mejorada del promotor durante la fase de crecimiento y la alta retención del plásmido durante el proceso. El sistema de expresión también evita la formación de agregados de proteína insoluble limitando la tasa de expresión máxima durante la fase de producción.

En una realización preferente dicho bacteriófago de ARN se selecciona del grupo que consiste en: a) bacteriófago Qβ; b.) bacteriófago AP205; c.) bacteriófago fr; d.) bacteriófago GA; e.) bacteriófago SP; f.) bacteriófago MS2; g.) bacteriófago M11; h.) bacteriófago M1; i.) bacteriófago NL95; j.) bacteriófago f2; k.) bacteriófago PP7 y l.) bacteriófago R17. Preferentemente, dicho bacteriófago de ARN es Qβ. Más preferentemente, dicha proteína de la cápside recombinante comprende, o de manera alternativa consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, y SEQ ID NO:11. Aún más preferentemente, dicha proteína de la cápside recombinante comprende la SEQ ID NO:5, más preferentemente, dicha proteína de la cápside recombinante consiste en la SEQ ID NO:5.

En una realización más preferentemente, dicha proteína de la cápside recombinante comprende o de manera alternativa consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, y SEQ ID NO:14. Más preferentemente, dicha proteína de la cápside recombinante comprende SEQ ID NO:12, más preferentemente, dicha proteína de la cápside recombinante consiste en la SEQ ID NO:12.... [Seguir leyendo]

1. Proceso para la expresión de una proteína de la cápside recombinante de un bacteriófago o un mutante o fragmento de la misma capaz de formar una VLP mediante auto-ensamblaje, en donde dicho bacteriófago es un bacteriófago de ARN, y en donde dicho proceso comprende los pasos de:

a.) introducir un plásmido de expresión en un huésped bacteriano, en donde dicho plásmido de expresión comprende un constructo de expresión, en donde dicho constructo de expresión comprende (i) una primera secuencia de nucleótido que codifica dicha proteína de la cápside recombinante, o mutante o fragmento de la misma, y (ii) un promotor que es inducible por lactosa;

b) cultivar dicho huésped bacteriano en un medio que comprende una fuente de carbono principal; en donde dicha fuente de carbono principal es glucosa o glicerol; y en donde dicho cultivo se realiza en cultivo discontinuo y en condiciones bajo las cuales dicho promotor se reprime por lacl, en donde dicho lacl es sobreexpresado por dicho huésped bacteriano;

c) alimentar dicho cultivo discontinuo con dicha fuente de carbono principal; y d) inducir dicho promotor con un inductor, en donde se continúa dicha alimentación de dicho cultivo discontinuo 15 con dicha fuente de carbono principal.

2. Proceso según la reivindicación 1, en donde dicho bacteriófago se selecciona del grupo que consiste en: a.) bacteriófago Qβ; b.) bacteriófago AP205: c.) bacteriófago fr;

d.) bacteriófago GA; e.) bacteriófago SP; f.) bacteriófago MS2; g.) bacteriófago M11; h.) bacteriófago MX1;

i.) bacteriófago NL95; j.) bacteriófago f2; k.) bacteriófago PP7 y l.) bacteriófago R17.

3. Proceso según la reivindicación 1, en donde dicho bacteriófago es el bacteriófago Qβ o bacteriófago AP205, 30 preferentemente bacteriófago Qβ.

4. Proceso según la reivindicación 1, en donde dicho bacteriófago es el bacteriófago Qβ y en donde dicha proteína de la cápside recombinante tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5.

5. Proceso según la reivindicación 1, en donde dicho constructo de expresión comprende una primera secuencia de nucleótido y una segunda secuencia de nucleótido, en donde dicha primera secuencia de nucleótido codifica Qβ CP 35 o un mutante o fragmento de la misma, y en donde dicha segunda secuencia de nucleótido codifica la proteína A1 de Qβ o un mutante o fragmento de la misma, y en donde dicha primera y dicha segunda secuencias de nucleótidos están separadas exactamente por un tramo de secuencias que comprende al menos un codón finalizador TAA, y en donde preferentemente dicho constructo de expresión comprende o de manera alternativa consiste en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:6; y en donde más preferentemente dicho plásmido de expresión comprende o de

manera preferente consiste en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en: a.) promotor tac; b.) promotor trc; c.) promotor tic;

d.) promotor lac; e.) promotor lacUV5;

f.) promotor Psyn;

g.) promotor lppa;

h.) promotor lpp-lac;

i.) promotor T7-lac;

j.) promotor T3-lac;

k.) promotor T5-lac; y l.) un promotor que tiene al menos 50% de homología de secuencia a la SEQ ID NO:2; y en donde preferente dicho promotor comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:2.

7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha fuente de carbono principal es glicerol; y en donde preferentemente dicha alimentación de dicho cultivo discontinuo se realiza a una tasa de flujo, en donde dicha tasa de flujo aumenta con un coeficiente exponencial µ, y en donde más preferentemente dicho coeficiente exponencial µ es inferior a µmax.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha inducción de dicho promotor se realiza mediante la co-alimentación de dicho cultivo discontinuo con dicho inductor y dicha fuente de carbono principal a una tasa de flujo constante o a una tasa de flujo creciente.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho inductor es IPTG.

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho inductor es lactosa.

11. Proceso según la reivindicación 8, en donde dicho inductor es lactosa, y en donde dicha lactosa y dicha fuente de carbono principal son co-alimentadas a dicho cultivo discontinuo en una proporción de 2:1 a 1:4 (w/w) .

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho lacl es sobreexpresado por dicho huésped bacteriano, en donde dicha sobreexpresión es provocada por lacIq o lacQ1, preferentemente por lacIq.

13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha alimentación de dicho cultivo discontinuo y dicha inducción de dicho promotor se realiza a una temperatura que es inferior a la temperatura de crecimiento óptima de dicho huésped bacteriano, en donde preferentemente dicha temperatura se encuentra entre 27 y 32ºC, más preferentemente entre 28 y 31°C en donde más preferentemente dicha temperatura es de 30°C.

14. Proceso según la reivindicación 1, en donde:

a.) dicho plásmido de expresión comprende o preferentemente consiste en la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1. b.) dicha fuente de carbono principal es glicerol;

c.) dicha alimentación de dicho cultivo discontinuo se realiza con una tasa de flujo, en donde dicha tasa de flujo aumenta con un coeficiente exponencial µ, y en donde preferentemente dicho coeficiente exponencial µ es inferior a µmax.

d.) dicho inductor es lactosa;

e.) y dicha lactosa y dicha fuente de carbono principal son co-alimentadas a dicho cultivo discontinuo en una proporción de 2:1 a 1:4 (w/w) , preferentemente de 1:1 a 1:3 (w/w) , más preferentemente de 1:3 (w/w) ; f.) dicho huésped bacteriano es E. coli RB791; y g.) dicho cultivo y alimentación de dicho cultivo discontinuo y dicha inducción de dicho promotor se realizan a una temperatura de aproximadamente 30ºC. 10 15. Proceso según la reivindicación 1, en donde:

a.) dicho plásmido de expresión comprende o preferentemente consiste en la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:30. b.) dicha fuente de carbono principal es glicerol; c.) dicha alimentación de dicho cultivo discontinuo se realiza con una tasa de flujo, en donde dicha tasa de flujo aumenta con un coeficiente exponencial µ, y en donde preferentemente dicho coeficiente exponencial µ es inferior a µmax.

d.) dicho inductor es lactosa; e.) dicha lactosa y dicha fuente de carbono principal son co-alimentadas a dicho cultivo discontinuo en una proporción de 2:1 a 1:4 (w/w) , preferentemente de 1:1 a 1:3 (w/w) , más preferentemente de 1:3 (w/w) ; 20 f.) dicho huésped bacteriano es E. coli RB791; y g.) dicho cultivo y alimentación de dicho cultivo discontinuo y dicha inducción de dicho promotor se realizan a una temperatura de aproximadamente 30ºC.

Glicerol [g/L], Lactosa [g/L], Actividad betaGal [U/ml*OD=1]

Figura 1/1 Fermentación QT0602, Inducción con co-alimentación (20% glicerol + 20% lactosa)

Tiempo de cultivo [h]