Un procedimiento para disminuir un nivel de agregación de un antagonista de hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo;

(b) cargar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo incluyendo cualquier impureza y cualquier agregación del mismo en una resina de intercambio aniónico (AEX), en el que la carga se conduce a una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 10 mS/cm, a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 y a una concentración de proteína de menos de o igual a aproximadamente 10 g de proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de AEX; y

(c) separar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilada e isoformas del mismo mediante cromatografía de AEX

Procedimiento para disminuir los niveles de agregación de proteína pegilada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a procedimientos recombinantes para preparar un polipéptido pegilado deseado. Este procedimiento o procedimientos producen un producto de polipéptido pegilado que contiene niveles reducidos de agregación y/o determinadas impurezas de isoformas de los mismos. En particular, la presente invención también se refiere a un procedimiento recombinante para preparar un antagonista de la hormona del crecimiento (por ejemplo, tal como pegvisomant y su proteína intermedia) con agregación y/o impurezas de isoformas de las mismas disminuidas. Más específicamente, las impurezas de isoformas que se disminuyen mediante los procedimientos de la presente invención son las impurezas de isoforma trisulfuro y des-phe del antagonista de la hormona del crecimiento (o su intermedio). También, la agregación es la agregación indeseada del antagonista de la hormona del crecimiento pegilado.

Antecedentes de la invención

Pegvisomant (Somavert®; Pharmacia Corp.) es un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. Es un análogo de la hormona del crecimiento humana ("hGH") que se ha alterado estructuralmente. La secuencia de aminoácidos del componente proteico/intermedio (B-2036) de pegvisomant difiere de la secuencia de aminoácidos de hGH en nueve posiciones. Las sustituciones de aminoácidos específicas son las siguientes: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, B174S e I179T. Como se reconoce bien en la técnica, la primera letra (es decir, H18D) representa el aminoácido en la secuencia de hGH en la posición numerada (es decir, 18^va posición de aminoácido indicada por H18D) que se sustituye con el aminoácido indicado por la segunda letra (es decir, H18D). Por lo tanto, H18D indica una sustitución del aminoácido his por el aminoácido asp en la 18^va posición de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de hGH de tipo silvestre.

La Figura 1A muestra esquemáticamente la estructura de la secuencia de aminoácidos del componente proteico/intermedio (B-2036) de pegvisomant (PEG B-2036 o B-2036 PEG) con asteriscos que indican los sitios potenciales de unión del polímero polietilenglicol (unidad "PEG"). Adicionalmente, la lista de secuencias de aminoácidos del componente proteico/intermedio (B-2036 - sin unión de unidad PEG) de pegvisomant se identifica en este documento como SEC ID Nº 1. Para comparación, la lista de secuencias de aminoácidos de la hormona del crecimiento humana se identifica en este documento como SEC ID Nº 2. Ambas listas de secuencias se proporcionan juntas en este documento. Véase también Jorgensen y col., "Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under hydrophobic conditions", J. Chromatography A 817: 205-214 (1998) para la secuencia de hGH.

Estructuralmente, pegvisomant es una proteína (que contiene 191 restos aminoacídicos) a la cual están unidas covalentemente principalmente de 4 a 6 unidades de PEG. El peso molecular del componente proteico/intermedio (B-2036) de pegvisomant es 21.998 Daltons. El peso molecular de cada unidad de PEG de pegvisomant es aproximadamente 5000 Daltons. Por lo tanto, los pesos moleculares predominantes de pegvisomant son aproximadamente 42.000 (4 unidades de PEG/molécula), 47.000 (5 unidades de PEG/molécula) y 52.000 (6 unidades de PEG/molécula) Daltons.

Con referencia al agonista y sin estar limitado por la teoría, se cree que la hGH endógena activa sus receptores cuando una molécula única de hGH se une a dos de sus moléculas receptoras adyacentes (e idénticas), induciendo la homodimerización de receptor mediada por hormona. Véanse, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.849.535 y 6.057.292. La actividad de hGH depende de su capacidad de unirse a dos de sus receptores adyacentes (e idénticos) a través de dos sitios de unión separados (sitio 1 y sitio 2) en la misma molécula de hGH. Estos sitios de unión de hGH, denominados sitio 1 y sitio 2, se numeran 1 y 2 para reflejar el orden de su unión a dos receptores de hGH adyacentes (e idénticos) que median la homodimerización dependiente de hGH.

Además, sin estar limitado por la teoría, se cree que pegvisomant se une selectivamente a receptores de la hormona del crecimiento humana ("receptores de GH") sobre las superficies celulares, donde el mismo bloquea la unión de la hormona del crecimiento humana endógena, interfiriendo de ese modo con la transducción de señal de la hormona del crecimiento humana. Las modificaciones estructurales a la parte proteica (también denominada "componente" o "intermedio") de pegvisomant (con relación a hGH) permiten que pegvisomant bloquee competitivamente la interacción entre una molécula de hGH y un receptor de hGH. Pegvisomant se une al receptor de GH, bloqueando de este modo la unión de GH ya que el receptor está ocupado. Las modificaciones estructurales evitan la dimerización de receptor y como resultado no ocurre la transducción de señal. Bloqueando de este modo la interacción cercana necesaria entre una molécula de hGH y un receptor de hGH, pegvisomant bloquea la homodimerización mediada por hGH de los receptores de hGH, lo cual proporciona a pegvisomant su actividad antagonista.

Este antagonista se usa para tratar afecciones, que incluyen, pero sin limitación, acromegalia en pacientes que no responden de forma adecuada a cirugía, terapia de radiación y/u otras terapias médicas convencionales o que de otra manera no pueden tolerar estas terapias. Además, las modificaciones estructurales a la parte proteica (B-2036) de pegvisomant provocan que el mismo muestre una afinidad de unión por el receptor de prolactina que es inferior a la de hGH, minimizando de ese modo los efectos secundarios indeseados relacionados con la lactancia asociados con el uso de pegvisomant.

La parte de intermedio proteico (B-2036) de pegvisomant se sintetiza mediante una cepa de bacterias Escherichia coli que se ha modificado genéticamente mediante la adición de un plásmido que porta un gen para el antagonista del receptor de la hormona del crecimiento (B-2036). B-2036 después se recupera a partir de las células microbianas y se purifica. Después, el B-2036 purificado se pegila para producir pegvisomant (PEG B-2036). Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.849.535 y 6.057.292 describen procedimientos para preparar B-2036 y procedimientos para conjugar una o más unidades de PEG a B-2036, aunque sin detalles con referencia a cómo disminuir, reducir, eliminar, invertir y/o evitar la formación de niveles inaceptablemente altos de las impurezas de isoformas trisulfuro y des-phe de las mismas.

Uno de los problemas encontrados usando procedimientos de preparación recombinantes convencionales para preparar B-2036 es la formación de sus impurezas de isoformas, tales como sus isoformas des-phe y trisulfuro. Otro de los problemas encontrados usando procedimientos de preparación y purificación convencionales para preparar B-2036 PEG (es decir, B-2036 pegilado tal como pegvisomant) a partir de B-2036 es la formación de una "agregación" indeseable de B-2036 PEG como se analiza adicionalmente más adelante.

La impureza de isoforma des-phe es una en la que a la molécula de B-2036 le falta su fenilalanina amino-terminal. Véase la Figura 1A que representa el resto de fenilalanina amino-terminal objeto (es decir, indicado por la letra "F") adyacente al extremo NH₂ de B-2036. La impureza de isoforma trisulfuro es una en la que la molécula de B-2036 contiene un átomo de azufre adicional que forma un "puente trisulfuro" dentro de la molécula. Véase el recuadro en la Figura 1B. También, véase Andersson y col, "Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli", Int. J. Peptide Protein Res. 47: 311-321 (1996) y A. Jesperson y col., "Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli", Eur. J. Biochem. 219: 365-373 (1994). Sin estar limitado por la teoría, se cree que estas impurezas de isoforma típicamente se generan durante el crecimiento (por ejemplo, fermentación) y expresión (síntesis y secreción) celular de B-2036 en células huésped modificadas genéticamente y/o durante la extracción y purificación de la proteína de B-2036.

Con relación al problema con la "agregación", la formación de tal "agregación" conduce a una producción disminuida de la proteína deseada y a un coste aumentado para producir la misma. También,...

1. Un procedimiento para disminuir un nivel de agregación de un antagonista de hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha resina de AEX se selecciona entre el grupo constituido por ANX4^TM, DEAE^TM, Q-Sefarosa^TM, Q-Sefarosa FF^TM, Q-Sefarosa HP^TM y Q-Sefarosa XL^TM.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que, en la etapa (b), la carga se conduce a una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 5 mS/cm.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que, en la etapa (b), la carga se conduce a una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 2,4 mS/cm.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa (b) se conduce a un pH de carga de AEX de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 9.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa (b) se conduce a un pH de carga de AEX de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo comprenden antagonista de la hormona del crecimiento (GH) e isoformas del mismo pegilados en uno o más sitios.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo comprenden una o más de dichas isoformas del antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado seleccionadas entre el grupo constituido por:

9. El procedimiento de la reivindicación 1, comprendiendo además una etapa de combinación (d) para combinar cantidades específicas de las isoformas del antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado para producir un antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado combinado mediante una técnica seleccionada entre el grupo constituido por:

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado combinado comprende uno o más de PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 y PEG-9.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que una fracción antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilada combinada de PEG-4, PEG-5 y PEG-6 comprende al menos aproximadamente el 70% en peso basándose en un peso total de dichas isoformas del antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 y PEG-9 y cualquier agregación de los mismos.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho nivel disminuido de dicha agregación es menor que o igual a aproximadamente el 10% en peso basándose en un peso total de dichas isoformas y dicha agregación.