Polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis,

en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)

Direccionamiento de agentes farmacéuticos a tejidos lesionados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al direccionamiento de agentes farmacéuticos, mas específicamente al use de dominios de unión a colágeno para dirigir agentes farmacéuticos a un tejido deseado.

Antecedentes de la invención

La arteriopatía coronaria isquémica es una de las causas principales de morbididad y mortalidad en los Estados Unidos. Los enfoques terapéuticos actuales incluyen la modificación de factores de riesgo, la reducción de la demanda de oxigeno del miocardio, y la restauración localizada del flujo al sistema arterial coronario mediante angioplastia, endoprótesis, o derivación coronaria. Estas opciones de tratamiento a menudo son insuficientes y una cantidad significativa de pacientes incluso no son candidatos para las opciones quirúrgicas. Se han hecho algunos intentos para mejorar el suministro sanguíneo del flujo coronario al miocardio isquémico por injerto o con medidas para agrandar los vasos sanguíneos existentes.

La angiogénesis terapéutica es un proceso que puede usarse para desarrollar vasos sanguíneos colaterales al miocardio. El término "angiogénesis" se refiere a un proceso de vascularización tisular que implica el desarrollo de nuevos vasos. La angiogénesis es un proceso complejo que implica la descomposición de la matriz extracelular, con proliferación y migración de células endoteliales y del músculo liso provocando finalmente la formación y organización de nuevos vasos sanguíneos (Folkman, J., y Klagsbrun, M., Science 235: 442-7, 1987). La angiogénesis típicamente sucede mediante uno de tres mecanismos: (1) neovascularización, donde las células endoteliales migran desde vasos pre-existentes que comienzan la formación de los nuevos vasos; (2) vasculogénesis, donde los vasos surgen a partir de células precursoras de novo; o (3) expansión vascular, donde vasos pequeños existentes se agrandan en diámetro para formar vasos más grandes (Blood, C.H., y Zetter, B.R., Biochem, Biophys. Acta. 1022: 89-118, 1990). La angiogénesis es un proceso importante en los procesos normales del crecimiento neonatal y en el sistema reproductor femenino durante el ciclo de crecimiento del cuerpo lúteo (véase. Moses, M.A., et al., Science 248: 1408-10, 1990). En condiciones normales, todos los procesos que implican la nueva formación o el remodelado de vasos sanguíneos existentes o nuevos es un proceso auto-limitante, y la expansión de los tipos celulares específicos esta controlada y coordinada. La angiogénesis también esta implicada en la curación de heridas y en la patogénesis de una gran cantidad de enfermedades clínicas incluyendo inflamación tisular, artritis, asma, crecimiento tumoral, retinopatía diabética, y otras afecciones. Las manifestaciones clínicas asociadas con la angiogénesis se conocen como enfermedades angiogénicas (Folkman y Klagsbrun, 1987, supra).

La expresión "factores de crecimiento" se refería originalmente a sustancias que promueven el crecimiento celular. Se usa para indicar las moléculas que funcionan como estimuladores del crecimiento (mitógenos) pero también como inhibidores del crecimiento (a veces mencionados como factores de crecimiento negativos). también se sabe que los factores de crecimiento estimulan la migración celular (por ejemplo, citoquinas mitogénicas), funcionan como agentes quimiotácticos, inhiben la migración celular o la invasión de células tumorales, modulan las funciones diferenciadas de las células, están implicados en la apoptosis y promueven la supervivencia de las células. Dichos factores pueden secretarse como factores difundibles y también pueden existir en formas ancladas a membrana. Pueden, por lo tanto, actuar de un modo autocrino, paracrino, yuxtacrino o retrocrino. Una citoquina es un tipo de factor de crecimiento.

El término "citoquina" se usa coma un nombre genérico para un grupo diverso de proteínas y péptidos solubles que actúan como reguladores humorales a concentraciones nano a picomolares y que, en condiciones normales o patológicas, modulan las actividades funcionales de células individuales y tejidos. Estas proteínas también median interacciones entre células directamente y regulan procesos que tienen lugar en el entorno extracelular. Las citoquinas comprenden interleuquinas, que inicialmente se creía que se producían exclusivamente por lo leucocitos; linfoquinas, que inicialmente se creía que se producían exclusivamente por los linfocitos; monoquinas, que inicialmente se creía que se producían exclusivamente por los monocitos; interferones, que inicialmente se creía que estaban implicados en respuestas antivirales; factores estimuladores de colonias, que inicialmente se creía que soportaban el crecimiento de células en medios semisólidos; y quimioquinas, que se creía que estaban implicadas en la quimiotaxis, y una diversidad de proteínas diferentes. In vivo, la expresión de la mayoría de las citoquinas esta estrictamente regulada; estos factores habitualmente se producen solamente por células activadas en respuesta a una señal de inducción.

En general, las citoquinas actúan sobre un espectro mas amplio de células diana que las hormonas. Quizás la característica principal que distingue las citoquinas de los mediadores considerados generalmente como hormonas es el hecho de que, a diferencia de las hormonas, las citoquinas no se producen por células especializadas que se organizan en glándulas especializadas; no hay una única fuente orgánica para estos mediadores. El hecho de que las citoquinas sean proteínas secretadas también significa que los sitios de su expresión no predicen necesariamente los sitios en los que ejercen su función biológica. Se ha descubierto que algunas citoquinas, después de la determinación sus estructuras primarias, son idénticas a enzimas clásicas (por ejemplo: el factor derivado de leucemia de células T adultas (ADF), nm23, el factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF, o neuroleuquina). Las citoquinas normalmente no tienen actividades enzimáticos aunque hay una lista creciente de excepciones. Las actividades biológicas de las citoquinas pueden medirse por una diversidad de bioensayos que emplean, entre otras cosas, líneas celulares dependientes de factor, o las citoquinas pueden medirse por otros ensayos usando, por ejemplo, anticuerpos. El fenotipado por amplificación de mensaje emplea técnicas modernas de biología molecular y detecta la presencia de ARNm específicos de citoquinas.

Muchos experimentos han sugerido que los tejidos pueden producir factores angiogénicos que promueven la angiogénesis en condiciones de mal suministro sanguíneo durante condiciones tanto normales como patol6gicas. Se ha demostrado que varios factores angiogénicos in vivo promueven la angiogénesis en el miocardio isquémico, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), entre citoquinas y otras moléculas (Lopez y Simons, Drug Delivery 3:143, 1996). Estos factores y compuestos difieren en la especificidad celular y en los mecanismos por los que inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Por ejemplo, pueden inducir la migración y proliferación de células endoteliales a estimular la producción de colagenasa (véase Klagsbrun, M., y D'Amore, P.A., Ann. Rev. Physiol. 53:211-39, 1991). Hay varios bioensayos que permiten la determinación directa de actividades angiogénicos (Wilting, et al., Anat. Embrol. (Berl) 183:259-71, 1991).

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una proteína altamente glicosilada homodimérica de 46-48 kDa (subunidades de 24 kDa) (para una revisión véase Ferrara, N., et al., J. Cell Bio. 47:211, 1991; Ferrara, N., et al., Endocrin. Rev. 13:18-32, 1991). La glicosilación no es necesaria, sin embargo, para la actividad biológica. Las subunidades se unen por enlaces disulfuro. El factor humano existe en varias variantes moleculares de 121, 165, 189, y 206 aminoácidos, que surgen por corte y empalme alternativo del ARNm. Se han descrito varias variantes diferentes de VEGF, incluyendo 10 VEGF-B, VEGF-C, y VEGF-D. La variante de 189 aminoácidos de VEGF (VEGF-189) es idéntica al factor de permeabilidad vascular (VPF). VEGF-121 y VEGF-165 son formas secretadas solubles del factor mientras que VEGF-189 y VEGF-206 están principalmente unidas a proteoglicanos que contienen heparina en la superficie celular o en la membrana basal. El VEGF de rata y bovino es un aminoácido más corto que el factor humano, y las secuencias bovina y humana muestran una homología del 95%....

1. Polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

2. Polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que dicho agente modulador de la angiogénesis estimula la proliferación de células endoteliales.

3. Polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho dominio de unión a colágeno es un dominio de unión a colágeno de un factor de von Willebrand.

4. Polipéptido de fusión de la reivindicación 3, en el que dicho dominio de unión a colágeno del factor de von Willebrand comprende el decapéptido WREPSFMALS (SEC ID NO 1).

5. Polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente modulador de la angiogénesis es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

6. Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6, unida de forma funcional a un promotor.

8. Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7.

9. Vector de expresión de la reivindicación 8, siendo dicho vector de expresión un vector retroviral.

10. Célula hospedadora que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7.

11. Método para producir el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende cultivar las células hospedadoras de la reivindicación 10 en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico y recuperar el polipéptido de fusión.

12. Método de la reivindicación 11, en el que el hospedador es una célula procariota.

13. Método de la reivindicación 11, en el que el hospedador es una célula eucariota.

14. Uso del polipéptido de fusión según las reivindicaciones 1-5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno en un sujeto, seleccionado entre enfermedad cardiovascular, una lesión ulcerativa, una lesión inflamatoria, un tumor, y artritis.

15. Uso del ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno en un sujeto, seleccionado entre enfermedad cardiovascular, una lesión ulcerativa, una lesión inflamatoria, un tumor, y artritis.

16. Uso de la reivindicación 14 ó 15, en el que el sujeto es un ser humano.

17. Injerto tisular, que comprende tejido aislado que comprende células endoteliales tratadas con un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

18. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es tejido vascular.

19. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es un vaso.

20. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es piel.

21. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es un órgano.

22. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho órgano es el corazón.

23. Método para preparar el injerto tisular de cualquiera de las reivindicaciones 17-22 que comprende poner en contacto tejido aislado con una cantidad eficaz de un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

24. Método para activar el injerto tisular de cualquiera de las reivindicaciones 17-22 que comprende poner en contacto un tejido aislado con una cantidad. eficaz de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), de modo que dicha secuencia de ácido nucleico se exprese en dicho tejido activando de este modo el injerto.

25. Método de la reivindicación 24, en el que dicha secuencia de ácido nucleico está en un vector de expresión.

26. Composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27. Composición farmacéutica que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. Injerto tisular de cualquiera de las reivindicaciones 17-22 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 23-25, en el que el polipéptido de fusión es el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 2-5.