PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE PATOGENOS CON USO DE BALIZAS MOLECULARES.

Un procedimiento de detección de la presencia de al menos un patógeno que comprende poner en contacto un ácido nucleico obtenido de una muestra con un conjunto que comprende al menos cuatro sondas en las que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno flanqueada por cuatro partes de bases complementarias,

en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico del patógeno, en la que dicha sonda está etiquetada con una primera etiqueta que interacciona y una segunda etiqueta que interacciona tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de dicho patógeno provoca un cambio en la señal detectada

La presente invención se refiere a diagnósticos específicamente para organismos asociados con enfermedades de transmisión sexual y más particularmente a la detección de genotipos del virus del papiloma humano (VPH), de forma particular genotipos del virus del papiloma humano genital. Virus del papiloma humano y su importancia

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer de cuello uterino es la segunda causa más común de muerte por cáncer en mujeres. La presencia de infección por VPH se ha visto implicada en más del 99% de los cánceres de cuello uterino en todo el mundo. Según estimaciones, más de 500.000 mujeres en todo el mundo desarrollan cáncer de cuello uterino cada año, y más de 273.000 de los casos son fatales. Incluso con programas de seguimiento Pap un número significativo de mujeres fallecen de cáncer de cuello uterino cada año.

La infección por VPH es la enfermedad de transmisión sexual (ETS) más frecuente en todo el mundo y hasta el 60% de las mujeres sexualmente activas serán infectadas por VPH en el tracto genital una vez en su vida. Independientemente del estado de infección por VPH, menos de 1 de 10.000 mujeres desarrollarán cáncer de cuello uterino invasivo. De hecho la mayoría de las mujeres infectadas con VPH no desarrollan anormalidades citológicas o el cáncer resalta la importancia de factores que modulan la progresión de la enfermedad de cuello uterino a cáncer en mujeres infectadas con VPH. Estos factores pueden incluir el genotipo de VPH y variante molecular, la carga viral de VPH, persistencia de la infección por VPH, coinfección con otros agentes de ETS, el estado inmune del huésped y factores ambientales tales como fumar.

Los virus del papiloma son pequeños virus de ADN que infectan las células epiteliales de mamíferos, que provocan lesiones proliferativas epiteliales que pueden ser benignas, por ejemplo, fibropapilomas (verrugas), o que pueden ser malignas. Todos los virus del papiloma son similares en cuando comparten tamaño del genoma, organización, marcos de lectura abiertos y funciones de proteínas. Muchas, pero no todas, las regiones del genoma se conservan entre los diversos virus del papiloma.

Debido a la estrecha asociación entre el ciclo de vida del virus del papiloma y el estado de diferenciación de la célula huésped, los detalles del ciclo de vida del virus del papiloma no se han elucidado por completo. Se sabe que los virus del papiloma infectan células basales del epitelio del huésped, donde los genomas virales comienzan a establecerse y se mantienen como episomas de bajo número de copias que se replican en coordinación con la replicación de la célula huésped. Debido a que las células infectadas se diferencian en queratinocitos, el ADN viral es amplificado, los últimos genes son inducidos y continúa la replicación vegetativa del virus del papiloma.

Los virus del papiloma infectan una amplia variedad de animales, incluyendo seres humanos. Los virus del papiloma humano (VPH) (incluyendo la familia de virus del papiloma, alfa-, beta-, gama-, delta-, mu-papiloma y virus de papiloma no clasificados) son causas comunes de enfermedad de transmisión sexual. Se han identificado varios tipos de VPH con datos de secuencia de ADN, y se han secuenciado completamente hasta la fecha 96 genotipos de VPH. La genotipificación de VPH se basa en secuencias de ADN de los genes L1, E6 y E7. Una diferencia del 10% en la secuencia con respecto a las cepas establecidas previamente es suficiente para definir nuevo tipo de virus.

La heterogeneidad del grupo de virus del papiloma humano se describe en general en deVilliers, 1989, J. Virology 63: 4898-4903. Se han secuenciado y/o caracterizado los genomas de numerosos tipos de VPH.

Los VPH son virus de tumor de ADN cuyo genoma está organizado en tres regiones: las regiones de gen temprano (E1 a E7), las regiones del gen tardío (L1 y L2) y la región reguladora superior (RRS) o la región de control de longitud (RCL). La RRS posee sitios de unión para muchos represores y activadores de transcripción, lo que sugiere que puede jugar un papel en la determinación del conjunto de huéspedes para tipos de VPH específicos. Entre tanto, E1 y E2, codifican proteínas que son vitales para la replicación extracromosomal de ADN y para completar el ciclo de vida viral. El E2 codifica dos proteínas: una que inhibe la transcripción de la región temprana; y la otra, que aumenta la transcripción de la región temprana. Un rasgo distintivo de carcinoma de cuello uterino asociado a VPH es la pérdida de la expresión de las proteínas E2 virales. Recientemente se describió una nueva proteína E2 constituida por el producto del ORF (marco de lectura abierto) de E8 pequeña con la parte de la proteína E2. Esta proteína es capaz de reprimir tanto la replicación como la transcripción viral, y por tanto se cree que tiene un papel principal en la latencia viral.

La proteína E4 se expresa en las fases últimas de la infección se están ensamblando cuando viriones completos y no se conoce que tengan propiedades de transformación; sin embargo se considera que juegan un importante papel para la maduración y replicación del virus. La proteína E4 también induce el colapso de la red de citoqueratina citoplásmica en queratinocitos humanos, una situación que puede ayudar a la liberación de viriones de la célula infectada.

El marco de lectura abierto (ORF) de E5, entre tanto, se elimina frecuentemente en células de carcinoma de cuello uterino, lo que indica que podría no ser esencial en el mantenimiento de la transformación maligna de la célula huésped. Cuando está presente la E5 interacciona con diversas proteínas transmembranales como los receptores del factor de crecimiento epidérmico, factor β de crecimiento derivado de las plaquetas, y factor de estimulación de colonias. Un estudio que usa células infectadas con VPH 16 encontró que la proteína E5 posee débil actividad de transformación.

En carcinogénesis, los ORF (marcos de lectura abiertos) de E6 y E7 se considera que juegan el papel más importante. Estas dos unidades codifican oncoproteínas que permiten la replicación del virus y la inmortalización y transformación de la célula que hospeda el ADN de VPH.

Las unidades de la región tardía, L1 y L2 codifican las proteínas de la cápsida viral durante las últimas fases del ensamblaje del virión. La proteína codificada por L1 se conserva ampliamente entre las diferentes especies del virus del papiloma. La proteína de la cápsida menor codificada por L2 tiene más variaciones de secuencia que la de la proteína L1.

VPH puede infectar las células basales de epitelio de la piel o revestimientos tisulares internos y se categorizan, de acuerdo con esto, como de tipo cutáneo o de tipo mucosal (anogenital).

El ADN de VPH es normalmente extracromosal o episomal en lesiones de precursor de cuello uterino benignas. No obstante, en muchas células de cáncer de cuello uterino así como también en líneas de células de cáncer de cuello uterino y queratinocitos humanos transformados con VPH in vitro, el ADN de VPH se integra en el genoma del huésped.

Los tejidos de cáncer pueden contener tanto ADN de VPH episomal como integrad al mismo tiempo, si bien la integración parece tener lugar más frecuentemente en cáncer de cuello uterino asociado con VPH 18 que en cáncer de cuello uterino asociado con VPH 16. El VPH 16 integrado está presente en algunas lesiones premalignas pero no está siempre presente en carcinomas. Durante la integración de ADN de VPH el genoma viral se rompe normalmente en la región E1/E2. La ruptura conduce normalmente a la pérdida de las regiones E1 y E2. La pérdida de E2, que codifica proteínas incluyendo una que inhibe la transcripción de las regiones E6 y E7, se sabe que da lugar a expresión no controlada y mayor de las proteínas oncogénicas E6 y E7. Entre tanto, se ha observado que la mayor expresión de E6 y E7 conduce a la transformación maligna de las células huésped y a formación de tumor. La integración viral de VPH en el ADN genómico del huésped se asocia con progresión del estado policlonal al monoclonal en neoplasia intraepitelial de cuello uterino (NIC), y estos eventos juegan un papel fundamental en la progresión de neoplasia de cuello uterino de bajo grado a alto grado.

Los modelos de desequilibrio de número de copia de ADN (CNI) son característicos del grado de lesión intraepitelial escamosa (LIE) de cuello uterino, estado del virus del papiloma humano (VPH) y recurrencia post-operatoria. Aunque algunos...

1. Un procedimiento de detección de la presencia de al menos un patógeno que comprende poner en contacto un ácido nucleico obtenido de una muestra con un conjunto que comprende al menos cuatro sondas en las que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno flanqueada por cuatro partes de bases complementarias, en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico del patógeno, en la que dicha sonda está etiquetada con una primera etiqueta que interacciona y una segunda etiqueta que interacciona tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de dicho patógeno provoca un cambio en la señal detectada.

2. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicha primera etiqueta que interacciona y dicha segunda etiqueta que interacciona son un donador TERF y aceptor TERF.

3. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 2, en el que dicho aceptor TERF es un desactivante.

4. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno está conectada con dicho(s) par(es) de bases complementarias en cualquier extremo mediante secuencias de unión.

5. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos pares de bases complementarias comprenden pares C-G.

6. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dicha sonda comprende la secuencia

7. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia única para el patógeno dentro de la sonda contiene al menos una discrepancia con la secuencia genómica del patógeno.

8. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que cada una de dichas sondas se puede distinguir de una de las otras citadas sondas.

9. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que cada una de dichas sondas está unida a un sustrato sólido en una localización definida.

10. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho conjunto de sondas comprende al menos 10, al menos 15 o al menos 20 sondas.

11. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho procedimiento comprende además la determinación de la temperatura de fusión de la molécula de ácido nucleico de doble hebra formada por una de dichas sondas y ácido nucleico complementario obtenido de dicha muestra.

12. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho ácido nucleico obtenido de una muestra se amplifica antes de ponerse en contacto con dicho conjunto de sondas.

13. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 12, en el que dicha amplificación se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (RCP).

14. El procedimiento de la reivindicación 12 o reivindicación 13, en el que la producción de ácido nucleico amplificado es controla de forma continua.

15. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicho ácido nucleico amplificado se pone en contacto con dicho conjunto de sondas después de un ciclo de amplificación.

16. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicho ácido nucleico amplificado se pone en contacto con dicho conjunto de sondas después de cada ciclo de amplificación.

17. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicha amplificación se lleva a cabo en presencia de dicho conjunto de sondas.

18. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en el que dicho procedimiento comprende además la amplificación de un control interno.

19. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en el que se evita la amplificación del ácido nucleico contaminante.

20. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 19, en la que dicha amplificación de ácido nucleico contaminante se evita llevando a cabo la amplificación en presencia de uracilo.

21. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 20 que comprende además el tratamiento de dicho ácido nucleico con uracil-ADN glicosilasa antes de las amplificación.

22. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha muestra se selecciona de aspirados bronquiales, orina, músculo masetero de próstata, eyáculo, sangre y muestras citológicas, raspaduras o biopsias de cuello uterino, vulva, ano, genitales, piel o laringe.

23. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para la detección de un organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual.

24. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la detección de la presencia de al menos un genotipo de VPH.

25. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 24 para la detección de genotipos de VPH de alto riesgo o bajo riesgo.

26. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 24 o reivindicación 25, en el que dicho conjunto de sondas comprende al menos una sonda que comprende al menos una de las secuencias seleccionadas de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 177.

27. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que dicho ácido nucleico obtenido de dicha sonda se amplifica usando al menos un cebador seleccionado de nº ID SEC 1 a 32.

28. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 27, en el que el ácido nucleico obtenido de dicha muestra se amplifica usando una mezcla de cebador que comprende nº ID SEC 1 a 32.

29. Un conjunto de sondas que comprende al menos cuatro sondas, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno flanqueado por cuatro partes de bases complementarias, en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico de patógeno, en el que dicha sonda se etiqueta con una primera etiqueta que interacciona y una segunda etiqueta que interacciona tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de dicho patógeno provoca un cambio en la señal detectada.

30. El conjunto de sondas como se reivindican en la reivindicación 29, en el que dicha primera etiqueta que interacciona y dicha segunda etiqueta que interacciona son un donador TERF y aceptor TERF.

31. El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 30, en la que dicho aceptor TERF es un desactivante.

32. El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en el que dicha secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno está unida a dicho(s) par(es) de bases complementarias en cualquier extremo mediante secuencias de unión.

33. El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en las que dichos pares de bases complementarias comprenden pares C-G.

34. El conjunto de sondas como se reivindican en la reivindicación 33, en el que cada una de dichas sondas comprende la secuencia

secuencia 3'-CGCG-F única para patógeno F'-CGCG-5', en la que F y F' son secuencias de unión opcionales.

35. El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, en el que la secuencia única para el patógeno dentro de la sonda contiene al menos una discrepancia con la secuencia genómica del patógeno.

36. El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 35, en el que cada una de dichas sondas se puede distinguir de cada una de las otras citadas sondas.

37. El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el que cada una de dichas sondas está unida a un soporte sólido en una localización definida.

38. El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 37, en el que dicho patógeno es un organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual.

39. El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 38, en el que dicho organismo es un virus.

40. El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 39, en el que dicho virus es virus del papiloma humano.

41. El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 40, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia que es complementaria con un genotipo de VPH.

42. El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 41, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia que es complementaria con un genotipo de VPH de alto riesgo.

43. El conjunto de sondas como se reivindican en la reivindicación 41, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia que es complementaria con un genotipo de VPH de bajo riesgo.

44. El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, en el que dicho conjunto de sondas comprende al menos una sonda que comprende al menos una de las secuencias seleccionadas de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 117.

secuencia 3'-CGCG-F única para patógeno F'-CGCG-5' en la que F y F' son secuencias de unión opcionales.

5 45. El conjunto de sondas de la reivindicación 44, en el que cada sonda de dicho conjunto de sondas comprende una secuencia selecciona de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 117.

46. El conjunto de sondas de la reivindicación 44 o reivindicación 45, en el que cada sonda de dicho conjunto de sondas comprende una secuencia seleccionada de nº ID SEC 33 a 52.

47. Un kit para la detección de uno o más patógenos que comprenden un conjunto de sondas como se reivindican en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 46.

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48. Un kit como se reivindica en la reivindicación 47, en el que dicho patógeno es un 15 organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual.

49. Un kit para la detección de uno o más genotipos de VPH que comprende un conjunto de sondas como se reivindican en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 46.

20 50. El kit como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 49 que comprende además un control interno.

51. El procedimiento de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente la etapa de

calentar a aproximadamente 55º C durante aproximadamente 5 minutos antes de la 25 amplificación.