CRISTALES DE ANALOGOS DE INSULINA Y PROCEDIMIENTO PARA SU PRODUCCION.

Cristales del análogo de insulina, la insulina humana Lys B3, Glu B29, estando los cristales presentes en et grupo espacial R3 (nº 146) con los ejes de celda A = 81,5 Å ± 1 Å y C = 33,3 Å ± 1 Å, y estando las moléculas del análogo de insulina presentes en forma de hexámeros libres de zinc, que consisten en cada caso en tres dímeros

Cristales de análogos de insulina y procedimiento para su producción.

La invención se refiere a cristales de un análogo de insulina en el que la asparagina (Asn) en la posición B3 de la cadena B está reemplazada por un resto de aminoácido básico existente en la naturaleza, y al menos un resto de aminoácido en las posiciones B27, B28 o B29 de la cadena B está reemplazado por otro resto de aminoácido neutro o ácido existente en la naturaleza, donde la fenilalanina (Phe) en ta posición B1 de la cadena B puede estar ausente opcionalmente, estando los cristales presentes en el grupo espacial R3 (nº 146) con los ejes de celda A = 81,5 Å pm 1 Å y C = 33,3 Å pm 1 Å.

Por todo el mundo, aproximadamente 120 millones de personas sufren diabetes mellítus. Entre éstas, aproximadamente 12 millones son diabéticos de tipo I, para los que la administración de insulina es la única terapia posible actualmente. La gente afectada tiene una dependencia de las inyecciones de insulina de por vida, por lo general varias veces al día. Aunque la diabetes de tipo II, que sufren aproximadamente 100 millones de personas, no está acompañada en principio de falta de insulina, en un gran número de casos el tratamiento con insulina está considerado como la forma de terapia más favorable o única posible.

Con la duración progresiva de la enfermedad, un gran número de los pacientes sufren "complicaciones diabéticas tardías". En este caso se trata, esencialmente, de daños micro y macrovasculares, los cuales, dependiendo del tipo y alcance, da como resultado fallo renal, ceguera, pérdida de las extremidades o un aumento del riesgo de enfermedades cardiovasculares.

Como causa de ello se han considerado principalmente responsables los niveles de glucosa en sangre crónicamente elevados, ya que incluso con un ajuste cuidadoso de la terapia con insulina, no se consigue un perfil normal de glucosa en sangre, como correspondería a la regulación fisiológica (Ward, J.D. (1989) British Medical Bulletin 45, 111-126; Drury, P.L. et al. (1989) British Medical Bulletin 45, 127-147; Kohner, E.M. (1989) British Medical Bulletin 45, 148-173).

En la persona sana, la secreción de insulina es estrechamente dependiente de la concentración de glucosa de la sangre. Los niveles de glucosa elevados, como sucede después de las comidas, son rápidamente compensados por un aumento en la liberación de insulina. En estado de ayuno, el nivel de insulina en plasma disminuye hasta un valor basal, que es suficiente para garantizar un suministro continuo de glucosa a los órganos y tejidos sensibles a la insulina. Una optimización de la terapia, la denominada "terapia con insulina intensificada", está hoy dirigida principalmente a mantener las variaciones de la concentración de glucosa en sangre, especialmente las desviaciones hacia arriba, tan bajas como sea posible (Bolli, G.B. (1989) Diabetes Res. Clin, Pract. 6, P3-P16; Berger, M. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, pág. 25-pág. 32). Esto conduce a una disminución importante en la incidencia y el progreso del daño diabé- tico tardío (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986).

A partir de la fisiología de la secreción de la insulina puede deducirse que para una terapia mejorada e intensificada con insulina usando preparaciones administradas por vía subcutánea, se necesitan dos preparaciones de insulina que tengan propiedades farmacodinámicas diferentes. Para la compensación del aumento de glucosa en sangre después de las comidas, la insulina debe liberarse rápidamente y puede que sólo actúe durante unas pocas horas. Para el suministro basal, en particular durante la noche, debería estar disponible una preparación que actúe durante más tiempo, que no tenga un máximo pronunciado y que sólo se libere muy lentamente.

Sin embargo, las preparaciones basadas en insulinas humanas y animales satisfacen las demandas de una terapia con insulina intensificada sólo en una medida restringida. Las insulinas activas rápidamente (insulinas viejas) alcanzan la sangre y el sitio de acción demasiado despacio y tienen una duración total de la acción excesivamente larga. El resultado es que los niveles de glucosa después de comer son demasiado altos, y varias horas después de la comida la glucosa en sangre disminuye demasiado (Kang, S. et al. (1991) Diabetes Care 14, 142-148; Home, P.J. et al. (1989) British Medical Bulletin 45, 92-110; Bolli, G.B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, pág. 3-pág. 16). Por su parte, las insulinas basales disponibles, especialmente las insulinas NPH, tienen una duración de la acción demasiado corta y poseen un máximo fuertemente pronunciado excesivamente.

Además de la posibilidad de influenciar el perfil de acción por medio de principios farmacéuticos, la ayuda de la ingeniería genética ofrece hoy la alternativa de diseñar análogos de insulina que consiguen ciertas propiedades, tales como el comienzo y la duración de la acción, por sí mismos, debido a sus propiedades estructurales. Por medio del uso de análogos de insulina adecuados, podría conseguirse por tanto un ajuste de la glucosa en sangre que sea significativamente mejor y más estrechamente adaptado a las condiciones naturales.

Análogos de insulina que tienen un comienzo acelerado de la acción se describen en los documentos EP 0 214 826, EP 0 375 437 y EP 0 678 522. EP 0 214 826 se refiere, entre otras cosas, a las sustituciones de B27 y B28, pero no en combinación con la sustitución de B3. EP 0 678 522 describe análogos de insulina que contienen varios aminoácidos, preferiblemente prolina, en la posición B29, pero no ácido glutámico. EP 0 375 437 comprende análogos de insulina que tienen lisina o arginina en B28, que pueden estar opcionalmente modificados adicionalmente en B3 y/o A21. En EP 0 885 961 A1 se describe la insulina humana B3-lisina, B29-glutamato como una insulina novedosa, de acción rápida.

En EP 0 419 504 se dan a conocer análogos de insulina que están protegidos frente a modificaciones químicas mediante el cambio de la asparagina en B3 y al menos un aminoácido más en las posiciones A5, A15, A18 o A21. Los análogos de insulina descritos aquí, sin embargo, tienen sólo una modificación en la posición B3 y ninguna modificación más del grupo mencionado. No hay indicación de que estos compuestos posean una farmacodinámica modificada que tenga como consecuencia un comienzo más rápido de la acción.

Los análogos de insulina son análogos de las insulinas existentes en la naturaleza, a saber, la insulina humana o insulinas animales, que difieren por la sustitución de al menos un resto de aminoácido existente en la naturaleza y/o la adición de al menos un resto de aminoácido y/o resto orgánico, de la insulina correspondiente, por lo demás idéntica, existente en la naturaleza.

La cadena A de la insulina humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn ; (SEC ID NO 1)

La cadena B de la insulina humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr ; (SEC ID NO 2).

De los veinte aminoácidos existentes en la naturaleza que son codificables genéticamente, los aminoácidos glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys), metionina (Met), asparagina (Asn), glutamina (Gln), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptófano (Trp) y prolina (Pro) se designan como aminoácidos neutros, los aminoácidos arginina (Arg), lisina (Lys) e histidina (His) se designan como aminoácidos básicos y los aminoácidos ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu) se designan como aminoácidos ácidos,

o su sal fisiológicamente tolerable, a saber, un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable de fórmula I, que se distingue en que

A8 es alanina (Ala), A9 es serina (Ser), A10 es valina (Val) y B30 es alanina (Ala) (restos de aminoácido A8 a A10 y B30 de la insulina bovina), A8 es treonina (Thr),

 

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Reivindicaciones:

1. Cristales del análogo de insulina, la insulina humana Lys B3, Glu B29, estando los cristales presentes en et grupo espacial R3 (nº 146) con los ejes de celda A = 81,5 Å pm 1 Å y C = 33,3 Å pm 1 Å, y estando las moléculas del análogo de insulina presentes en forma de hexámeros libres de zinc, que consisten en cada caso en tres dímeros.

2. Cristales según la reivindicación 1, en donde los restos de histidina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a una molécula de agua a través de puentes de hidrógeno.

3. Cristales según la reivindicación 1, en donde los restos de histidina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a un ion dihidrógeno-fosfato (H₂PO₄^-) a través de puentes de hidrógeno.

4. Cristales según la reivindicación 1, en donde los restos de histidina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a un ion monohidrógeno-fosfato (HPO₄^2-) a través de puentes de hidrógeno.

5. Cristales según la reivindicación 1, en donde los restos de histidina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a un ion sulfato (SO₄^2-) a través de puentes de hidrógeno.

6. Cristales según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los restos de histidina B10 de las moléculas del análogo de insulina en un hexámero están, en cada caso, plegados hacia su propio dímero, y no está presente la formación de puentes de hidrógeno de los restos de histidina B10 con una molécula de agua.

7. Preparación farmacéutica, caracterizada porque contiene al menos un cristal según una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Preparación farmacéutica según la reivindicación 7, caracterizada porque contiene además un excipiente que facilita la absorción del análogo de insulina a la sangre.

9. Preparación farmacéutica según la reivindicación 7, caracterizada porque contiene al menos un cristal según una de las reivindicaciones 1 a 6 y un excipiente, que se usa en formulaciones para inhalar y/u orales de insulina o análogos de insulina.

10. Uso de un cristal según una o más de las reivindicaciones 1 a 6 para la producción de una preparación farmacéutica que tiene una actividad insulínica con un comienzo rápido de la acción.

11. Procedimiento para la preparación de un cristal según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que

(a) un polvo amorfo, libre de zinc, del análogo de insulina según las reivindicaciones 1 a 10 se disuelve en agua en una concentración de 15-25 mg/ml, (b) se lleva a cabo una precipitación usando un precipitante adecuado, y (c) los cristales se aíslan y se secan.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el precipitante se selecciona de un grupo que contiene

(a) dihidrógeno-fosfato de amonio, (b) una combinación de dihidrógeno-fosfato de amonio y citrato trisódico; y (c) una combinación de sulfato de amonio y polietilenglicol de diversos pesos moleculares.

13. Procedimiento para la preparación de los cristales según una o más de las reivindicaciones 1, 3, 4 y 6 por un procedimiento según la reivindicación 12, en el que como precipitante se usa dihidrógeno-fosfato de amonio o hidrógeno-fosfato de diamonio a valores de pH entre 3,0 y 8,0.

14. Procedimiento para la preparación de los cristales según una o más de las reivindicaciones 1 a 6 por un procedimiento según la reivindicación 12, en el que como precipitante se usa dihidrógeno-fosfato de amonio/hidrógeno-fosfato de diamonio en combinación con citrato trisódico a un valor del pH de 5,5 pm 1,5, o sulfato de amonio en combinación con PEG de diversos pesos moleculares a un valor del pH de 6,0 pm 1,5.

15. Uso de un cristal según una de las reivindicaciones 1 - 6 para la producción de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de los tipos I y/o II.

 

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