Una proteína constituida esencialmente por el precursor de contortrostatina purificado o variantes y fragmentos biológicamente activos del mismo,

estando constituida dicha proteína por una secuencia de aminoácidos al menos un 95% homóloga a:

a) los aminoácidos número 191 a 410 de la SEC ID Nº: 2;

b) los aminoácidos número 1 a 190 de la SEC ID Nº: 2; o

c) la SEC ID Nº 2

Contortrostatina (CN) y procedimientos para su uso en la prevención de metástasis y otras afecciones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la bioquímica y la medicina y, en particular, a la clonación, secuenciación y producción de contortrostatina y su precursor.

Antecedentes de la invención

El cáncer de mama es una de las causas principales de muerte entre las mujeres no fumadoras y la extensión de la enfermedad desde la mama hasta sitios lejanos es una causa importante de muerte en los pacientes con cáncer de mama. En el momento del diagnóstico más del 60% de los pacientes con cáncer de mama tendrán una enfermedad que se habrá extendido desde el sitio primario en la mama hasta algún sitio lejano. La extensión del cáncer a sitios remotos, por ejemplo, hueso, pulmones, hígado, cerebro, un proceso denominado metástasis, es una característica de malignidad y con frecuencia conduce a una enfermedad inoperable. La metástasis es el factor más común que conduce a la muerte desde el cáncer de mama. El control de la metástasis ofrece un importante camino para el tratamiento del cáncer de mama. Las células cancerosas metastatizan a través de los vasos sanguíneos o linfáticos. La primera etapa de la metástasis implica la unión de células cancerosas a tejidos alrededor del sitio primario, es decir, a la matriz extracelular (MEC) por medio de integrinas de la superficie celular y otros receptores de adhesión. Las integrinas median interacciones célula-célula y célula-sustrato y están implicadas en una señalización bidireccional que asocia la MEC con proteínas del citoesqueleto. Las integrinas juegan un papel importante en la interacción de células de carcinoma mamario con la MEC. En la segunda etapa, las células cancerosas secretan enzimas digestivas que degradan los tejidos circundantes, permitiendo a las células tumorales invadir esos tejidos. Finalmente, las células tumorales entran en el sistema sanguíneo o linfático donde repiten las etapas de adhesión e invasión en un sitio lejano (metastásico). En este sitio remoto, las células tumorales inducen la formación de nuevos vasos sanguíneos (un proceso denominado neovascularización) en y alrededor del tumor en crecimiento. Estos nuevos vasos sanguíneos suministran nutrientes al tumor metastásico y permiten que crezca. Los tratamientos que bloquean cualquiera de estas etapas actuarían inhibiendo la metástasis.

Las integrinas en las células cancerosas juegan papeles importantes en la invasión y la extensión tumoral. Son una familia de proteínas que se encuentran en la superficie celular de muchos tipos celulares que median interacciones entre células, y entre células y sus alrededores. La CN se une a una integrina específica en la superficie de las plaquetas sanguíneas y bloquea la capacidad de las plaquetas de adherirse entre sí (un proceso denominado agregación plaquetaria). Las plaquetas son fragmentos pequeños de células de médula ósea que se encuentran en el torrente sanguíneo. Tienen actividades tanto beneficiosas como perjudiciales. Su acción útil es la de detener la hemorragia después de una lesión facilitando la formación de un coágulo sanguíneo. Pero, en ciertas condiciones, están implicadas en el bloqueo de las arterias que suministran nutrientes al corazón -una acción que puede conducir a un ataque cardiaco. Las integrinas son heterodímeros, compuestos de subunidades a y ß implicadas en interacciones célula-célula y célula-sustrato. Las integrinas sirven como receptores para proteínas de la matriz extracelular tales como fibronectina, fibrinógeno, vitronectina, colágeno y laminina. Se ha mostrado que algunas de estas interacciones están mediadas por una secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) presente en las proteínas de la matriz. Se necesita tanto la subunidad a como la subunidad ß para la unión al fibrinógeno. Por ejemplo, uno de los miembros de la superfamilia de receptores de superficie celular de integrina es la glicoproteína de la membrana plaquetaria (GP)IIb/IIIa que interacciona con el fibrinógeno plasmático en la agregación plaquetaria. Se han investigado receptores de superficie celular de integrina en el papel de las plaquetas en la mediación de la trombosis y retrombosis de arterias coronarias en la génesis del infarto de miocardio agudo [Zucker, M. B., Sci. American 242: 86 (1990)]. Para la agregación plaquetaria, es esencial una secuencia RGD presente en el fibrinógeno para la interacción con (GP)IIb/IIIa [Ginsberg, M. H. y col., Thrombos. Haemostas. 59: 1 (1988)]. Debido a su inhibición de la agregación plaquetaria, el veneno de serpiente ha sido el objeto de diversas investigaciones.

Se ha descubierto que varias proteínas purificadas a partir de veneno de serpientes de las familias Crotalidae y Viperídae inhiben la agregación plaquetaria mediada por la glicoproteína (GP)IIb/IIIa [véase, por ejemplo, Huang, T. F. y col., J. Biol. Chem. 262: 16157 (1987); Gan, Z. R. y col., J. Biol Chem. 263: 19827 (1988); Yasuda, T. y col., J. Am. Coll. Cardiol. 16: 714 (1990); Trikha, M. y col., Fibrinolysis 4 (Supl. 1): 105 (1990); Trikha, M. y col., Blood 76 (Supl. 1): 479a (1990); Holahan, M. A. y col., Pharmacology 42: 340 (1991); Shebuski, R. J. y col., Circulation 82: 169 (1990); Yasuda, T. y col., Circulation 83: 1038 (1991)]. Estas proteínas, clasificadas como desintegrinas, típicamente son ricas en enlaces disulfuro. Además, todas las desintegrinas aisladas de este manera con la excepción de la barbourina [Scarborough, R. M. y col., J. Biol Chem. 266: 9359 (1991)] contienen una secuencia RGD (Arg-Gly-Asp) que se ha implicado en la inhibición de interacciones mediadas por integrina. En particular, la secuencia RGD de las desintegrinas puede competir por sitios de unión al fibrinógeno en la membrana de las plaquetas, inhibiendo de esta forma la agregación plaquetaria inducida por ADP u otros agentes.

Sin embargo, parece haber cada vez más pruebas de que las desintegrinas pueden tener una geometría superficial única que facilita las interacciones con integrinas por mecanismos distintos de los basados únicamente en el sitio RGD. Por ejemplo, el descubrimiento de que un derivado mutado sintetizado químicamente de equistatina (en el que la arginina en la secuencia RGD se sustituyó por alanina) aún poseía alguna actividad biológica, sugiere que otras regiones en la proteína pueden estar implicadas en la unión y que puede haber cierta flexibilidad en el sitio de unión a RGD [Connolly, T. M. y col., Circulation 82. (Supl. III): 660 (1990)]. Los péptidos RGD sintéticos, debido a su pequeño tamaño, generalmente no poseen la topografía molecular de las desintegrinas y por lo tanto no pueden interaccionar por medio de la multiplicidad de mecanismos que probablemente están implicados en la unión de la desintegrina.

En otras investigaciones, se ha informado sobre la prevención de la reoclusión después de una trombolisis usando activador de plasminógeno de tipo tisular en un sistema modelo canino usando 30 µg/kg más 3 µg/kg/min de bitistatina, una desintegrina de 83 aminoácidos procedente del veneno de Bitis arietans [Shebuski y col., anteriormente], o 15 µg/kg/min de equistatina i.v., una desintegrina de 49 aminoácidos procedente del veneno de Echis carínatus [Holahan y col., anteriormente]. En los procedimientos notificados, se usó una inyección en embolada inicial de heparina (100 U/kg i.v.) e inyecciones en embolada posteriores cada hora de 50 U/kg para aumentar los tiempos de tromboplastina parcial activada al menos 1,5 veces con respecto al control. Aunque previamente se había observado que la heparina en combinación con el activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA) no afectaba a la incidencia de reoclusión aguda en este sistema modelo, la adición de equistatina o bitistatina conduce a reducciones espectaculares en la incidencia de reoclusión trombótica aguda. Sin embargo, la administración de heparina era aparentemente necesaria para la prevención de la reoclusión trombótica aguda.

De forma similar, se evaluó la kistrina (una desintegrina de 68 aminoácidos procedente del veneno de Agkistrodon rhodostoma) junto con activador de plasminógeno de tipo tisular recombinante en un modelo canino de trombosis de arteria coronaria con estenosis de alto grado superpuesta [Yasuda y col. (1991), anteriormente]. Se determinó que una dosis eficaz de 4 µg/kg/min era suficiente para prevenir la reoclusión. Se usó anticoagulación con heparina terapéutica sistémica simultánea; la dosis de heparina se seleccionó para mantener el tiempo de tromboplastina parcial activada a más del doble a lo largo de todo el...

1. Una proteína constituida esencialmente por el precursor de contortrostatina purificado o variantes y fragmentos biológicamente activos del mismo, estando constituida dicha proteína por una secuencia de aminoácidos al menos un 95% homóloga a:

2. Una proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 constituida por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:

4. Una proteína purificada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) constreñida en el extremo de un bucle peptídico flexible de aproximadamente 13 restos aminoacídicos flanqueado por dos restos Cys, en la que el bucle peptídico es un antagonista de integrina que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos número 457 a 469 de la SEC ID Nº: 2.

5. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha variante biológicamente activa es una proteinasa de unión a metal, o desintegrina.

6. Una preparación de proteína contortrostatina codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1.

7. Una preparación de proteína contortrostatina de acuerdo con la reivindicación 6, careciendo sustancialmente dicha preparación de otros componentes de veneno de serpiente.

8. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica contortrostatina.

9. Una molécula de ADN purificada constituida esencialmente por una secuencia de nucleótidos que codifica contortrostatina, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo constituido por:

10. Un vector que comprende una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 10, seleccionándose dicha célula huésped entre el grupo constituido por células animales, células vegetales, células de insecto, levadura y otros hongos y bacterias.

12. Un procedimiento para producir contortrostatina que comprende la etapa de cultivar la célula huésped de la reivindicación 11.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, que comprende además la etapa de recuperar la contortrostatina expresada por la célula huésped.

14. Una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.