COMPOSICIONES UTILIZABLES PARA REGULAR LA ACTIVIDAD DE LA PARQUINA.

Polipéptido que interactúa con la parquina que presenta en toda su longitud una identidad de al menos 95% con la secuencia SEQ ID Nº: 2

Composiciones utilizables para regular la actividad de la parquina.

La presente invención se refiere a composiciones y métodos utilizables para regular la actividad de la parquina. Se refiere principalmente a una nueva proteína, denominada PAP1, pareja de la parquina, así como a los péptidos o polipéptidos derivados u homólogos de esta proteína. Se refiere principalmente a compuestos capaces de modular al menos parcialmente la actividad de la parquina, principalmente de interferir con la interacción entre la parquina y la PAP1. La presente invención se puede usar en los campos terapéuticos, de diagnóstico o para la constitución de dianas farmacológicas que permitan el desarrollo de nuevos medicamentos.

El gen de la parquina muta en algunas formas familiares (juveniles autosómicas recesivas) de la enfermedad de Parkinson (Kitada et al., 1998). La enfermedad de Parkinson (Lewy, 1912) es una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes que afecta a más de 15 de la población mayor de 55 años. Los pacientes afectados de esta enfermedad tienen trastornos neurológicos agrupados con el término de síndrome parquinsoniano, caracterizado por rigidez, bradiquinesia y temblores Estos síntomas son consecuencia de una degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra del cerebro.

La mayor parte de casos con enfermedad de Parkinson no tienen una historia familiar. Sin embargo, existen casos familiares de los que algunos corresponden a una forma monogénica de la enfermedad. Hasta el momento, solo se han identificado tres genes diferentes en algunas formas hereditarias raras. La primera forma corresponde a una forma autosómica dominante cuyo gen responsable codifica para la alfa sinucleina (Polymeropoulos et al., 1997). Esta proteína es un constituyente en la que abundan inclusiones intracitoplasmáticas, denominadas cuerpos de Lewy, que sirven como marcador de la enfermedad de Parkinson (Lewy, 1912). La segunda forma, igualmente autosómica dominante, está unida a una mutación en un gen que codifica para una hidrolasa denominada ubiquitina carboxiterminal hidrolasa L1 (Leroy et al., 1998). Se supone que esta enzima hidroliza los polímeros o los conjugados de las ubiquitinas en monómeros de ubiquitina. La tercera forma se distingue de las precedentes por una transmisión autosómica recesiva y un inicio a menudo antes de los 40 años, así como por una ausencia de cuerpos de Lewy. Estas enfermedades responden más favorablemente a la levodopa, un precursor de la dopamina usado como tratamiento de la enfermedad de Parkinson. El gen implicado en esta forma codifica para una nueva proteína denominada parquina (Kitada et al., 1998).

El gen de la parquina está constituido por 12 exones que cubren una región genómica de más de 500.000 pares de bases sobre el cromosoma 6 (6q25.2-q27). Hasta el momento se conocen dos tipos importantes de mutaciones de este gen en el origen de la enfermedad, bien deleciones de tamaño variable en la región que cubre los exones 2 a 9 o bien mutaciones puntuales que producen la aparición prematura de un codon de terminación o el cambio de un aminoácido (Kitada et al., 1998; Abbas et al., 1999; Lucking et al., 1998; Hattori et al., 1998). La naturaleza de estas mutaciones y el modo de transmisión autosómica recesiva sugieren una pérdida de función de la parquina que lleva a la enfermedad de Parkinson.

Este gen se expresa en un gran número de tejidos y principalmente en la sustancia negra. Existes varios tránscritos que corresponden a este gen y que provienen de empalmes alternativos diferentes (Kitada et al., 1998; Sunada et al., 1998). En el cerebro se encuentran dos tipos de ARN mensajero de los que uno está desprovisto de la parte correspondiente al exón 5. En los leucocitos se han identificado ARN mensajeros de la parquina que no contienen la región que codifica para los exones 3, 4 y 5. El más largo de los ARN mensajeros de la parquina, presente en el cerebro, contiene 2960 bases y codifica para una proteína de 465 aminoácidos.

Esta proteína tiene una pequeña homología en su parte N-terminal con la ubiquitina. Su extremo C-terminal contiene dos restos "ring finger" separados por un dominio IBR (por sus iniciales en inglés: "In Between Ring") que corresponde con un región rica en cisteina que puede unirse a metales como los dominios "dedos de zinc" (Morett, 1999). Se ha demostrado por inmunocitoquímica que la parquina está localizada en el citoplasma del aparato de Golgi de las neuronas de la sustancia negra que contienen melanina (Shimura et al., 1999). Además, esta proteína está presente en algunos cuerpos de Lewy de los enfermos de Parkinson. La función celular de la parquina aún no ha sido demostrada, pero podría tener un papel de transportador de las vesículas sinápticas, en la maduración o degradación de las proteínas y en el control del crecimiento, de la diferenciación o del desarrollo celular. En las formas autosómicas recesivas juveniles, la parquina está ausente confirmando así que la pérdida de esta función es responsable de la enfermedad.

La elucidación del papel exacto de la proteína parquina en el proceso de degeneración de las neuronas dopaminérgicas constituye por tanto un reto importante para la comprensión y el enfoque terapéutico de la enfermedad de Parkinson y, más generalmente, de las enfermedades del sistema nervioso central.

La presente invención se refiere a la identificación de una pareja de la parquina que interacciona con esta proteína en condiciones fisiológicas. Esta pareja representa una nueva diana farmacológica para la fabricación o la investigación de compuestos capaces de modular la actividad de la parquina, principalmente su actividad sobre la degeneración de las neuronas dopaminérgicas y/o el desarrollo de patologías nerviosas. Esa proteína, los anticuerpos, los ácidos nucleicos correspondientes así como las sondas o cebos específicos, son también utilizables para la detección o dosificación de las proteínas en muestras biológicas, en particular muestras de tejido nervioso. Estas proteínas o ácidos nucleicos son también utilizables en métodos terapéuticos para modular la actividad de la parquina, así como cualquier compuesto según la invención capaz de modular la interacción entre la parquina y los polipéptidos de la invención.

La presente invención resulta más particularmente de la demostración por la Solicitante de una nueva proteína humana, denominada PAP1 (por sus iniciales en inglés: Parkine Associated Protein 1) o LY111 que interacciona con la parquina. La proteína PAP1 (secuencias SEQ ID Nº: 1 ó 2) presenta cierta homología con las sinaptotagminas y es capaz de interactuar más particularmente con la región central de la parquina (representada por las secuencias SEQ ID Nº: 3 ó 4). La proteína PAP1 ha sido igualmente clonada, secuenciada y caracterizada a partir de diferentes tejidos de origen humano, principalmente del pulmón (SEQ ID Nº: 12, 13) y del cerebro (SEQ ID Nº: 42, 43), así como de formas cortas que corresponden a variantes de empalme (SEQ ID Nº: 14, 15, 44, 45).

La presente invención resulta igualmente de la identificación y de la caracterización de regiones particulares de la proteína PAP1, implicadas en la modulación de la función de la parquina. La demostración de la existencia de esa proteína y de regiones implicadas en su función permite en particular preparar nuevos compuestos y/o composiciones utilizables como agentes farmacéuticos y desarrollar métodos industriales de selección de tales compuestos.

Un primer objetivo de la invención se refiere a un polipéptido que interacciona con la proteína que presenta en toda su longitud una identidad de al menos 95% con la secuencia SEQ ID Nº: 2.

Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para la proteína PAP1, sus fragmentos, derivados u homólogos, así como cualquier vector que comprenda dicho ácido nucleico, cualquier célula recombinante que contenga dicho ácido nucleico o vector y cualquier mamífero no humano que comprenda en sus células dicho ácido nucleico.

La invención se refiere también a anticuerpos capaces de unir la proteína PAP1, sus fragmentos, derivados y homólogos, principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales, más preferentemente anticuerpos capaces de unir la proteína PAP1 y de inhibir al menos parcialmente su interacción con la parquina.

Otro aspecto de la invención se refiere a sondas o iniciadores nucleotídicos, específicos...

1. Polipéptido que interactúa con la parquina que presenta en toda su longitud una identidad de al menos 95% con la secuencia SEQ ID Nº: 2.

2. Polipéptido que presenta una de las secuencias SEQ ID Nº: 13 y SEQ ID Nº: 43.

3. Polipéptido que presenta una de las secuencias SEQ ID Nº: 15 y SEQ ID Nº: 45.

4. Ácido nucleico que codifica para un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Ácido nucleico según la reivindicación 4, caracterizado porque presenta una identidad de al menos 95% con la secuencia SEQ ID Nº: 1.

6. Ácido nucleico según la reivindicación 4, caracterizado porque presente una de las secuencias SEQ ID Nº: 12 y SEQ ID Nº: 42.

7. Ácido nucleico según la reivindicación 4 que presenta una de las secuencias SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 44.

8. Vector que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Virus recombinante defectivo que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7.

10. Composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Composición farmacéutica que comprende al menos un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7 o un vector según una de las reivindicaciones 8 ó 9.

12. Composición según una de las reivindicaciones 10 u 11 destinada al tratamiento de patologías neurodegenerativas.

13. Procedimiento para la selección o la caracterización de moléculas destinadas al tratamiento de patologías neurodegenerativas que comprende una etapa de selección de moléculas capaces de unir la secuencia SEQ ID Nº: 2, o un fragmento de ella.

14. Procedimiento para la selección o la caracterización de moléculas destinadas al tratamiento de patologías neurodegenerativas que comprende una etapa de selección de moléculas capaces de unir una secuencia elegida entre las secuencias SEQ ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 43 y SEC ID Nº: 45, o un fragmento de ellas.

15. Procedimiento de producción de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende el cultivo de una célula que contiene un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7 o un vector según la reivindicación 8 ó 9, en condiciones de expresión de dicho ácido nucleico, y la recuperación del compuesto peptídico producto.

16. Célula que contiene un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7 o un vector según la reivindicación 8 ó 9.

17. Mamífero no humano que comprende, en sus células, un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7.

18. Anticuerpos, fragmentos o derivados de anticuerpo dirigidos contra un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.