Sistema de traducción que comprende: un tRNA ortogonal (O-tRNA) que reconoce un codón selector;

y una sintetasa ortogonal (ORS) procedente de una lisil t-RNA sintetasa, la ORS siendo capaz de cargar específicamente homoglutamina en el O-tRNA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención pertenece al campo de la bioquímica de traducción. La invención se refiere a métodos para producir y a composiciones de ARNt ortogonales, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales y pares de los mismos, que incorporan aminoácidos no naturales, por ejemplo homoglutaminas, en proteínas en respuesta a codones selectores tales como codones selectores de cuatro bases y de terminación. Esto incluye la incorporación de múltiples aminoácidos no naturales diferentes en una única cadena proteica en respuesta a codones selectores de terminación y de cuatro bases. La invención también se refiere a métodos para producir proteínas en células usando dichos pares y composiciones relacionadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Aunque, con pocas excepciones, los códigos genéticos de todos los organismos conocidos codifican los mismos veinte aminoácidos, todo lo que se requiere para añadir un nuevo aminoácido al repertorio de un organismo es un único par de ARNt/aminoacil-ARNt sintetasa, una fuente del aminoácido y un único codón selector que especifique el aminoácido (Furter (1998) Protein Sci., 7: 419-426). Previamente hemos demostrado que el codón sin sentido ámbar, TAG, junto con pares ortogonales de ARNt/sintetasa de M. jannaschii y E. coli, se puede usar para codificar genéticamente una diversidad de aminoácidos con nuevas propiedades en

E. coli (Wang et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122: 5010-5011; Wang et al., (2001) Science, 292: 498-500; Wang et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A., 100: 56-61; Chin et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99: 11020-11024) y levadura (Chin y Schultz, (2002) ChemBioChem, 3: 11351137), respectivamente. El número limitado de codones de triplete no codificantes, sin embargo, restringe severamente el número final de aminoácidos codificados por cualquier organismo. [0003] Hay muchos ejemplos de supresores de desplazamiento del marco de lectura +1 de origen natural incluyendo supresores UAGN procedentes de Su7 que codifica glutamina (Magliery et al., (2001) J. Mol. Biol., 307:755769), supresores procedentes de sufJ de codones ACCN que codifican treonina (Anderson et al., (2002) Chem. Biol., 9:237-244) y supresores de CAAA procedentes de ARNtLys y ARNtGln (Anderson y Schultz, (2003) Biochemistry, 42(32): 9598-608). Además, se han usado selecciones genéticas para identificar de forma eficaz ARNt supresores de codones de cuatro y cinco bases de grandes bibliotecas de ARNt mutantes, incluyendo

Ser

un supresor ARNtUCCU de E. coli (Ibba et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A., 96: 418-423; Kwok y Wong, (1980) Can. J. Biochem., 58: 213-218). Este fenómeno natural se ha extendido para mutagénesis de aminoácidos no naturales in vitro usando ARNt aminoacilados químicamente. Se ha incorporado una diversidad de aminoácidos, incluyendo pares de fluoróforo/inactivador (Terada et al., (2002) Nat. Struct. Biol., 9: 257-262) en proteínas en respuesta a AGGU y CGGG (Hou et al., (1992) Biochemistry,

31: 4157-4160; Yarus et al., (1986) J. Mol. Biol., 192: 235-255; Miller, (1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y). Para expandir adicionalmente el código genético, existe la necesidad de desarrollar componentes mejorados y/o adicionales de la maquinaria biosintética, por ejemplo, ARNt ortogonales, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales y/o codones únicos. Esta invención cumple estas y otras necesidades, como será evidente después de la revisión de la siguiente descripción.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos sistemas de traducción que producen productos proteicos usando tRNA ortogonal y aminoacil tRNA sintetasas ortogonales según se indica en las reivindicaciones. La invención se refiere al sistema de traducción ensamblado, los procedimientos para usar el sistema de traducción y los productos de la traducción producidos por el sistema. Esta tecnología encuentra una serie de usos tal y como se discute en el presente documento, por ejemplo, pero no limitado a, la producción de productos terapéuticos, reactivos diagnósticos y enzimas industriales. [0005] En un aspecto, la presente invención proporciona un sistema de traducción que comprende:

un tRNA ortogonal (O-tRNA) que reconoce un codón selector; y

una sintetasa ortogonal (ORS) derivada de una lisil-tRNA sintetasa, dicha ORS siendo capaz de cargar de manera específica el O-tRNA con homoglutamina. [0006] En algunas realizaciones del sistema de traducción, el lisil O-ARNt, la variante del O-ARNt, la O-RS o tanto el O-ARNt como la O-RS, proceden de Pyrococcus horikoshii (PhKRS). Diversas O-RS que encuentran uso en el sistema de traducción incluyen PhKRS, E444G, PhAD y un mutante I41 y/o S268 de PhAD. En algunas realizaciones, la O-RS de Pyrococcus horikoshii, cuando se expresa en una célula E. coli, muestra una toxicidad que es igual o menor que la toxicidad de un mutante I41 y/o S268 de PhAD. [0007] El lisil O-ARNt o la variante de O-ARNt incluye opcionalmente una secuencia de reconocimiento para un codón de cuatro bases o un codón ámbar. Por ejemplo, el lisil O-ARNt o la variante puede incluir una secuencia de reconocimiento para AGGA. En aspectos relacionados del sistema de traducción, el lisil O-ARNt o la variante usa un bucle anti-codón con la secuencia CU(X)nXXXAA. En algunas realizaciones de este aspecto, la secuencia CU(X)nXXXAA puede ser CUCUAAA o CUUCCUAA. Los ejemplos incluyen el lisil O-ARNt o la variante del mismo que incluye las secuencias observadas en la SEC ID Nº: 24 o la SEC ID Nº: 26. [0008] En algunas realizaciones de la invención, la O-RS, el lisil O-ARNt o las variantes tienen una eficacia de al menos el 50% en la supresión de un codón selector de terminación o de desplazamiento del marco de lectura con respecto a E444G, PhAD o un mutante I41 y/o S268 de PhAD, en combinación con un O-ARNt de la SEC ID Nº: 24 o la SEC ID Nº: 26. En otras realizaciones, el sistema de traducción usa una O-RS adicional y un O-ARNt adicional, donde estos componentes adicionales suprimen un codón selector de desplazamiento del marco de lectura que es diferente de un codón selector de desplazamiento del marco de lectura suprimido por el lisil O-ARNt o la variante de O-ARNt y la O-RS que carga de forma preferente el lisil O-ARNt o la variante de O-ARNt. En otras realizaciones, el sistema de traducción suprime tanto un codón selector de cuatro bases como un codón selector de terminación en un ácido nucleico diana que codifica un polipéptido diana. El codón selector de cuatro bases usa opcionalmente la secuencia AGGA y el codón selector de terminación usa opcionalmente la secuencia TAG o UAG. En algunas realizaciones, el sistema de traducción incluye un ácido nucleico diana que comprende un codón selector de cuatro bases. El sistema de traducción incorpora opcionalmente una proteína codificada por el ácido nucleico diana. Por ejemplo, esta proteína puede incorporar un residuo de homoglutamina. [0009] El sistema de traducción incorpora opcionalmente un ácido nucleico diana que codifica un codón selector de cuatro bases y un codón selector de terminación. En algunos aspectos, el sistema de traducción incorpora una proteína codificada por el ácido nucleico diana, donde la proteína incluye al menos dos aminoácidos no naturales diferentes. [0010] La invención proporciona, por ejemplo, un sistema de traducción que usa un primer ARNt ortogonal (O-ARNt) que reconoce un codón selector de cuatro bases, una primera aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) que carga de forma preferente el O-ARNt con un primer aminoácido no natural, un segundo O-ARNt que reconoce un codón selector de terminación y una segunda O-RS que carga de forma preferente el segundo O-ARNt con un segundo aminoácido no natural. En una realización, el codón selector de cuatro bases es AGGA y el codón de terminación es UAG. Opcionalmente, el sistema de traducción está en una célula. [0011] En algunas realizaciones del sistema de traducción, el primer o segundo O-ARNt es un lisil ARNt ortogonal (lisil O-ARNt) o una variante modificada. Opcionalmente, el primer O-ARNt es un lisil ARNt ortogonal (lisil O-ARNt) o una variante adecuada y el segundo O-ARNt es un tirosil ARNt ortogonal (tirosil O-ARNt) o una variante adecuada. Opcionalmente, el sistema de traducción incorpora un ácido nucleico que codifica al menos un codón selector de cuatro bases y un codón selector de terminación. En estas realizaciones, el codón selector de cuatro bases puede ser AGGA y el codón selector de terminación...

1. Sistema de traducción que comprende:

un tRNA ortogonal (O-tRNA) que reconoce un codón selector; y una sintetasa ortogonal (ORS) procedente de una lisil t-RNA sintetasa, la ORS siendo capaz de cargar específicamente homoglutamina en el O-tRNA.

2. Sistema de traducción de la reivindicación 1, que comprende homoglutamina y un ácido nucleico de interés que comprende un codón selector, en donde la ORS aminoacila el O-tRNA con la homoglutamina, en donde el O-tRNA reconoce el codón selector y mantiene la incorporación específica de la homoglutamina en un polipéptido codificado por el ácido nucleico de interés.

3. Sistema de traducción de la reivindicación 1, en donde la ORS es un mutante 141 y/o S268 de la aminoacil tRNA sintetasa de SEC ID NO: 28 (PhAD).

4. Sistema de traducción de la reivindicación 1, en donde el sistema de traducción comprende una célula procariota y la ORS procede de una célula archae.

5. Sistema de traducción de la reivindicación 4, en donde el sistema de traducción comprende una célula E. coli y la ORS procede de una ORS de Pyrococcus horikoshii.

6. Composición que comprende la aminoacil t-RNA sintetasa de SEC ID NO: 28 (PhAD).

7. Aminoacil t-RNA sintetasa artificial procedente de la aminoacil t-RNA sintetasa de SEC ID NO: 28 (PhAD) capaz de cargar homoglutamina en un tRNA.

8. Aminoacil t-RNA sintetasa artificial de la reivindicación 7, en donde la sintetasa es una variante homóloga de PhAD, que comprende los residuos variantes en las posiciones correspondientes a Y268 y E41 de PhAD.

9. Aminoacil t-RNA sintetasa artificial de la reivindicación 7, que comprende una serina o glicina en la posición que corresponde a Y268 de PhAD.

10. Aminoacil t-RNA sintetasa artificial de la reivindicación 7, que comprende

5 una valina, treonina, serina, isoleucina o prolina en una posición que corresponde a E41 de PhAD.

11. Aminoacil t-RNA sintetasa artificial de la reivindicación 7, que comprende

una serina en una posición que corresponde a Y268 y una isoleucina en la 10 posición que corresponde a E41 de PhAD.

12. Aminoacil t-RNA sintetasa artificial de la reivindicación 7, en donde la sintetasa es capaz de cargar el tRNA de SEC ID NO: 26 con homoglutamina.

13. Ácido nucleico que codifica la aminoacil tRNA sintetasa de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

14. Vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la

reivindicación 13. 20

15. tRNA de SEC ID NO: 26.

16. DNA que codifica el tRNA de la reivindicación 15.