COMPLEJOS VESICULARES Y METODOS PARA LA PREPARACION Y UTILIZACION DE LOS MISMOS.

Procedimiento para obtener una composición que comprende complejos de un anestésico local y una molécula de ácido nucleico,

que comprende las etapas de combinar 0,01-2,5% p/v de anestésico local con 1 µg/ml-10 mg/ml de ácido nucleico en presencia de una sal a un pH de 4-8,5, y en el que dicho anestésico local contiene un nitrógeno catiónico, un pKa de aproximadamente 7 a 9, se une a ADN, y contiene un grupo hidrófobo

Complejos vesiculares y métodos para la preparación y utilización de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una composición que comprende complejos moleculares que incluyen anestésicos locales, a composiciones farmacéuticas que los comprenden, y a métodos para usarlos.

Antecedentes de la invención

Los anestésicos locales son un gran grupo de compuestos que incluyen varias clases de compuestos. Los compuestos químicos o biológicos naturales o sintéticos, fisiológicamente activos, y sus derivados, actúan en las membranas celulares y/o sobre moléculas receptoras específicas en las membranas celulares in vivo o in vitro. Los anestésicos locales se describen en De-Paula, E. y S. Schreier (1996) Braz. J. Med. Res. 29:877-894 y Ritchie, J.M. y N.M. Greene "Local Anesthetics", Capítulo 15 302-321, que se incorporan aquí como referencia, y describen anestésicos locales y sus usos.

Además, en la patente US nº 5.593.972, expedida el 14 de enero de 1997 a Weiner et al., y en la solicitud PCT PCT/US94/00899, las cuales se incorporan aquí como referencia, se describe el uso de anestésicos locales en combinación con moléculas de ácidos nucleicos para la transferencia génica in vivo de forma general, y en particular para protocolos de vacunación protectora y terapéutica así como para terapia génica y protocolos antisentido. Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional US 60/045.122 presentada el 30 de abril de 1997.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para obtener una composición caracterizada en las reivindicaciones, que incluye complejos de un anestésico local y una molécula de ácido nucleico.

En algunas formas de realización, el anestésico local es bupivacaína, etidocaína, tetracaína, procainamida, cloroprocaína, ropivacaína, prilocaína, mepivacaína, lidocaína, procaína, carbocaína, metilbupivacaína o cocaína. En algunas formas de realización, el ácido nucleico es ADN. En algunas formas de realización, el ácido nucleico es ADN plasmídico. En algunas formas de realización, los complejos comprenden además uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en: lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos neutros, tensioactivos aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes neutros, y detergentes aniónicos. En algunas formas de realización, los complejos comprenden además uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en proteínas, polipéptidos, péptidos, y fármacos/compuestos terapéuticos no proteicos. En algunas formas de realización, el ácido nucleico es ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un inmunógeno.

En algunas formas de realización, los complejos se forman combinando 0,1-5% (p/v) de anestésico local con 500 µg/ml-1500 µg/ml de ácido nucleico en presencia de una concentración de sal mayor que 2M a un pH de 6-7,5, seguido de la eliminación de la sal hasta una cantidad por debajo de 500 mM. En algunas formas de realización, las proteínas, polipéptidos, péptidos, o fármacos/compuestos terapéuticos no proteicos también se combinan con el anestésico local y el ácido nucleico para producir complejos que incluyen las proteínas, polipéptidos, péptidos, o fármacos/compuestos terapéuticos no proteicos.

La presente invención se refiere además a un método para suministrar una proteína, que incluye polipéptidos y péptidos, a una célula de un individuo. El método comprende la etapa de administrar al individuo una composición que comprende complejos que comprenden un anestésico local y una molécula de ácido nucleico. Los complejos comprenden moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica la proteína enlazada operablemente a secuencias reguladoras. Las moléculas de ácidos nucleicos son captadas por las células del individuo y son expresadas para producir la proteína.

La presente invención se refiere además a un método para suministrar una proteína, polipéptido, péptido, fármaco/compuesto terapéutico no proteico, partícula vírica intacta o su fragmento, o microorganismo a una célula de un individuo. El método comprende la etapa de administrar al individuo una composición que comprende complejos que comprenden un anestésico local, una molécula de ácido nucleico y la proteína, polipéptido, péptido, o fármaco/compuesto terapéutico no proteico.

La presente invención se refiere además a un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo. El método comprende la etapa de administrar al individuo una composición que comprende complejos que comprenden un anestésico local y una molécula de ácido nucleico. Los complejos comprenden moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica un inmunógeno enlazada operablemente a secuencias reguladoras. Las moléculas de ácidos nucleicos son captadas por las células del individuo, son expresadas para producir el inmunógeno, y se genera una respuesta inmunitaria frente al inmunógeno por el individuo. En algunas formas de realización, los complejos comprenden además una proteína o péptido inmunogénico. En algunas formas de realización, los complejos comprenden además una proteína fisiológicamente activa.

La presente invención se refiere además a un método para suministrar una molécula de ácido nucleico a una célula de un individuo. El método comprende la etapa de administrar al individuo una composición que comprende complejos que comprenden un anestésico local y una molécula de ácido nucleico. Los complejos comprenden moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína enlazada operablemente a secuencias reguladoras, un oligonucleótido antisentido, una ribozima o una molécula de ácido nucleico que forma un tríplex.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona complejos que comprenden anestésicos locales y moléculas de ácidos nucleicos. Tales complejos se forman espontáneamente cuando disoluciones de anestésicos locales y moléculas de ácidos nucleicos se combinan en proporciones específicas en condiciones químicas específicas. Los complejos pueden incluir compuestos adicionales conocidos por sus propiedades formadoras de membranas, tales como lípidos, tensioactivos y detergentes. Además, dentro de los complejos se pueden encapsular compuestos adicionales tales como proteínas, polipéptidos, péptidos, o fármacos/compuestos terapéuticos no proteicos.

Los complejos de la invención son útiles para suministrar materiales a las células in vitro e in vivo. Tales materiales incluyen moléculas de ácidos nucleicos así como proteínas, polipéptidos, péptidos, y fármacos/compuestos terapéuticos no proteicos. Según algunas formas de realización, la presente invención proporciona métodos para suministrar ácidos nucleicos y/o proteínas, polipéptidos, péptidos, y/o fármacos/compuestos terapéuticos no proteicos a células de un individuo.

Según algunas formas de realización, la presente invención proporciona métodos para suministrar moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas a células de un individuo, en los que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de las moléculas de ácidos nucleicos se expresa a fin de suministrar la proteína a tales células in vivo.

Según algunas formas de realización, la presente invención proporciona métodos para suministrar moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas inmunogénicas a células de un individuo, en los que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína inmunogénica de las moléculas de ácidos nucleicos se expresa a fin de suministrar la proteína inmunogénica a tales células, en los que se induce en el individuo una respuesta inmunitaria frente a la proteína inmunogénica. En algunas formas de realización, las moléculas de ácidos nucleicos también codifican proteínas inmunomoduladoras, en las que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica las proteínas inmunomoduladoras se expresa a fin de suministrar las proteínas inmunomoduladoras al individuo y efectuar, potenciar o de otro modo modular la respuesta inmunitaria inducida frente a la proteína inmunogénica. En algunas formas de realización, los complejos comprenden además una o más proteínas, polipéptidos, péptidos, o fármacos/compuestos terapéuticos...

1. Procedimiento para obtener una composición que comprende complejos de un anestésico local y una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de combinar 0,01-2,5% p/v de anestésico local con 1 µg/ml-10 mg/ml de ácido nucleico en presencia de una sal a un pH de 4-8,5, y en el que dicho anestésico local contiene un nitrógeno catiónico, un pKa de aproximadamente 7 a 9, se une a ADN, y contiene un grupo hidrófobo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los complejos se forman combinando 0,05-1,25% p/v de anestésico local con 100 µg/ml-1 mg/ml de ácido nucleico en presencia de menos de 500 mM de sal a un pH de 6-7,5.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los complejos se forman combinando 0,1-0,5% p/v de anestésico local con 500 µg/ml-1500 µg/ml de ácido nucleico en presencia de menos de 500 mM de sal a un pH de 6-7,5.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los complejos se forman combinando 0,1-0,5% p/v de anestésico local con 500 µg/ml-1500 µg/ml de ácido nucleico en presencia de más de 2M de sal a un pH de 6-7,5, seguido de la eliminación de la sal hasta una concentración por debajo de 500 mM.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los complejos comprenden además una proteína, polipéptido, péptidos, o fármaco/compuesto terapéutico no proteico, y las vesículas laminares se forman combinando 0,1-0,5% p/v de anestésico local con 500 µg/ml-1500 µg/ml de ácido nucleico y dicha proteína, polipéptido, péptidos, o fármaco/compuesto terapéutico no proteico en presencia de una concentración mayor que 2M de sal a un pH de 6-7,5, seguido de la eliminación de la sal hasta una concentración por debajo de 500 mM.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el mezclamiento se lleva a cabo mediante diálisis.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la diálisis se lleva a cabo durante un período de dos a tres horas.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la diálisis se lleva a cabo durante un período de cinco horas.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de sal es menor que 200 mM.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anestésico local es bupivacaína.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ácido nucleico es ADN.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho ácido nucleico es ADN plasmídico.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ácido nucleico es ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un antígeno patógeno.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ácido nucleico es ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un antígeno vírico.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho ácido nucleico es ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína asociada con una enfermedad hiperproliferativa.