Cepa de Actinosynnema pretiosum que tiene el número de registro de ATCC PTA-3921

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a un microorganismo que es una cepa bacteriana mutante de la especie Actinosynnema pretiosum, designada cepa PF4-4 (ATCC PTA-3921), que puede producir maitansinoides ansamitocinas tales como ansamitocina P-3 con rendimiento mejorado en comparación con cepas conocidas anteriores, y a métodos de producción de tales ansamitocinas maitansinoides a partir de dicha de cepa PF4-4.

2. Antecedentes de la invención

Las bacterias de la especie Actinosynnema pretiosum producen antibióticos maitansinoides citotóxicos (Higashide et al. Nature 270, 721-722, 1977). Las bacterias de esta especie originalmente se clasificaron y depositaron como Nocardia sp., sin embargo, la caracterización posterior que demostró la ausencia de cualquier ácido micólico, pared celular de tipo III/C (ácido meso-diaminopimélico y sin hidratos de carbono importantes en el diagnóstico), una falta de esporangios y la formación de elementos móviles, indicó que estas cepas son miembros del género Actinosynnema (Hasegawa, et al. “Motile Actinomycetes: Actinosynnema pretosium subsp. pretosium sp nov., subsp. nov., y Actinosynnema pretosium subsp. auranticum susp. nov.” Int. J. Sistem. Bacteriol. 33(2):314-320, 1983). [0003] Los maitansinoides producidos por bacterias se denominan ansamitocinas, y comprenden un grupo de antibióticos de ansamicinas bencenoides antitumorales que se distinguen entre sí por sus sustituciones en las posiciones C-3 y C-14, tal como se muestra mediante los sustituyentes R y R1 de la fórmula (I). [0004] Se han depositado varias cepas de Actinosynnema, tales como ATCC 315651, Actinosynnema pretiosum subsp. auranticum. Las propiedades metabólicas, fisiológicas y de producción de maitansanoide de ATCC 31565 se describen en las

patentes estadounidenses 4.331.598 y 4.450.234 concedidas a Hasegawa et al., expedidas el 25 de mayo de 1982 y el 22 de mayo de 1984, respectivamente. ATCC 31565 es una bacteria gram-positiva que puede crecer en una amplia gama de fuentes de carbono y que produce principalmente una mezcla de maitansinoides y de maitansinoides sustituidos con C-14hidroximetilo que puede recogerse del medio de crecimiento con bajo rendimiento. [0005] El documento WO01/77360 describe métodos para la producción de ansamitocina usando microorganismos productores de ansamitocina, en particular Actinosynnema pretiosum spp. tal como Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 y 31281. [0006] Los maitansinoides se aislaron originalmente de plantas africanas (Kupchan et al. J. Amer. Chem. Soc. 94, 5294-5295, 1972). La producción de maitansinoides a partir de tales fuentes era difícil porque estaban presentes en cantidades muy pequeñas. Posteriormente se aisló un microorganismo productor de maitansinoide de hojas de junco, que se clasificó como una nueva cepa del género Nocardia, Nocardia sp. cepa n.º C-15003 (N-1). Esta cepa se depositó como (ATCC 31281, y se da a conocer en la patente estadounidense 4.137.230 concedida a Hashimoto et al., expedida el 30 de enero de 1979, y la patente estadounidense

4.162.940 concedida a Higashide et al., expedida el 31 de julio de 1979. La purificación de maitansinoide a partir de esta bacteria requiere menos etapas y da como resultado un aumento del rendimiento en comparación con la purificación a partir de fuentes vegetales. [0007] Se aisló una segunda cepa productora de maitansinoide de hojas de junco, denominada Nocardia sp. cepa n.º C-14482 (N-1001), depositada como ATCC 31309. Esta cepa se da a conocer en la patente estadounidense 4.292.309 concedida a Higashide et al., expedida el 29 de septiembre de 1981. [0008] Se derivó una tercera cepa de ATCC 31309, designada C-14482, mediante un procedimiento de mutagénesis. Esta

tercera cepa se denominó Nocardia sp. n.º N-1231, y se depositó como ATCC 31565. Las patentes estadounidenses

4.331.598 concedida a Hasegawa et al., expedida el 25 de mayo de 1982, y 4.450.234 concedida a Hasegawa et al., expedida el 22 de mayo de 1984, dan a conocer ATCC 31565. [0009] Las tres cepas de Nocardia sp. anteriormente mencionadas producen maitansinoides denominados ansamitocinas en pequeñas cantidades. Por tanto, se han dado a conocer métodos para la producción de ansamitocina P-3 usando Nocardia sp. cepa n.º C-15003 (véase, patente estadounidense n.º 4.356.265, concedida a Hatano et al., expedida el 26 de octubre de 1982; y Hatano et al. “Selective accumulation of ansamitocins P-2, P-3 y P-4, and biosynthetic origins of their acyl moieties” Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984). Según estos métodos, se obtienen cantidades relativamente pequeñas del producto deseado, ansamitocina P-3, con rendimientos de aproximadamente 100 mg/l de caldo de fermentación. [0010] Los maitansinoides tienen potente actividad citotóxica y han demostrado fuerte actividad antitumoral cuando se administran en forma de conjugado con un agente de unión a células. Por ejemplo, la patente estadounidense

5.208.020 concedida a Chari et al., expedida el 4 de mayo de 1993, da a conocer un agente citotóxico que comprende uno o más maitansinoides unidos a un agente de direccionamiento celular tal como un anticuerpo, mediante el cual el maitansinoide se dirige hacia poblaciones de células seleccionadas para su destrucción mediante el agente de unión a células específico. Asimismo, la patente estadounidense 5.416.064, concedida también a Chari et al., expedida el 16 de mayo de 1995, da a conocer nuevos maitansinoides que se unen a agentes de unión a células mediante enlaces disulfuro escindibles, mediante los cuales se libera el maitansinoide intracelularmente. Estos conjugados tienen potencial farmacéutico para el tratamiento de diversos cánceres.

Debido a los muchos usos terapéuticos de los maitansinoides, existe una necesidad de nuevas cepas de bacterias que puedan producir ansamitocinas con rendimiento mejorado y en cantidades suficientes para facilitar el desarrollo comercial, por ejemplo, de tales agentes anticancerígenos tal como se describieron anteriormente y se dieron a conocer en las patentes estadounidenses 5.208.020 y

5.416.064. La presente invención satisface esta necesidad y más, tal como resultará evidente para un experto en la técnica al leer la descripción y los ejemplos siguientes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN [0012] La presente invención proporciona una cepa bacteriana, depositada como ATCC PTA-3921, también denominada en el presente documento “PF4-4,” que produce cantidades aumentadas de maitansinoides. Se obtuvo PF4-4 mediante mutación de la cepa original N-1231 (ATCC 31565) usando luz ultravioleta (luz UV), 1-metil-3-nitro-1-nitroso-guanidina (MNNG) y selección para detectar la producción de maitansinoide potenciada. [0013] Por tanto, en una primera realización, la invención comprende una cepa bacteriana mutada (PF4-4) de la especie Actinosynnema pretiosum que tiene el número de registro de ATCC PTA-3921. Esta cepa produce cantidades mucho más altas de ansamitocinas que la cepa original. [0014] Esta realización de la invención puede producir más de 500 mg/l de ansamitocina P-3, que es una mejora del rendimiento de 5 a 10 veces en comparación con la cepa original. [0015] Esta realización además puede producir cantidades sustanciales de otras especies de ansamitocinas, por ejemplo ansamitocinas P-2 y P-4. Además, las cantidades relativas de las especies de ansamitocinas específicas que se producen mediante esta realización de la invención pueden manipularse

de manera racional mediante la elección de la fuente de carbono usada para sustentar el crecimiento. [0016] Esta realización puede crecer con una amplia variedad de fuentes de carbono y, con la excepción de su capacidad para producir cantidades aumentadas de maitansinoides, es sustancialmente similar a la cepa original (ATCC 31565) con respecto a sus características morfológicas, físicas y metabólicas. [0017] En una segunda realización, la invención comprende un método para producir un ansamitocina, que comprende cultivar una cepa de Actinosynnema pretiosum tal como se define en la reivindicación 1 en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono adecuada. [0018] Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar una cepa bacteriana que puede potenciar la producción de maitansinoide, mediante lo cual tales maitansinoides son altamente citotóxicos y pueden usarse como agentes terapéuticos, por ejemplo en forma de un conjugado con un componente específico de células, en el tratamiento de muchas enfermedades, incluyendo cáncer. [0019] Un segundo objeto de la invención es proporcionar una cepa bacteriana...

1. Cepa de Actinosynnema pretiosum que tiene el número de registro de ATCC PTA-3921.

2. Método para producir una ansamitocina, que comprende

5 cultivar una cepa de Actinosynnema pretiosum según la reivindicación 1 en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono adecuada.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha

ansamitocina es una o más ansamitocinas de fórmula (I) o 10 isómeros de la misma:

**(Ver fórmula)**

en la que R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, acetilo, propionilo, isobutirilo, butirilo e isovalerilo, y R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo e hidroximetilo.

4. Método según la reivindicación 2, en el que la ansamitocina es ansamitocina P-3.

5. Método según la reivindicación 2, en el que dicha ansamitocina es predominantemente ansamitocina P-3 y

20 dicha fuente de carbono comprende una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en valina, ácido isobutírico, alcohol isobutílico e isobutilaldehído.