Un casete de expresión que comprende, en la dirección de transcripción,

funcionalmente unido a otro, una secuencia reguladora del promotor que es funcional en células vegetales o plantas, una secuencia de ácido nucleico que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y una secuencia reguladora terminal que es funcional en células vegetales o plantas, caracterizado en que la secuencia reguladora del promotor comprende, en la dirección de transcripción, las secuencias de ácido nucleico X, Y, Y y Z, según el cual x se representa por la SEQ ID NO: 1, Y se representa por la SEQ ID NO:2, y Z se representa por la SEQ ID NO: 3

Casete de expresión que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y plantas tolerantes a herbicidas que lo contienen.

La presente invención se refiere a un nuevo casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y a su uso para la obtención de plantas resistentes a herbicidas que la inhiben, en particular herbicidas de la familia de ácido fosfónico, en particular de la familia de N-fosfonometilglicina.

Estado de la técnica

Uno de los principales problemas en agricultura radica en controlar el desarrollo de plantas de autopropagación indeseables, o malas hierbas, en áreas en las que crecen cultivos. El desarrollo de malas hierbas conduce a un debilitamiento de las plantas de cultivo y a una disminución en los rendimientos obtenidos en su crecimiento. Para combatir estas plantas indeseables, se usan herbicidas, generalmente mediante pulverizado en los cultivos.

Existen muchos tipos de herbicidas, en particular herbicidas selectivos que actúan solo en un grupo de plantas particulares sin afectar a las plantas de cultivo. La desventaja de los herbicidas selectivos es que su espectro de actividad generalmente es restringido, lo que requiere el uso de otros herbicidas selectivos con diferentes espectros de actividad para controlar las malas hierbas de forma eficaz. La solución a ésta desventaja radica en el uso de herbicidas totales capaces de actuar sobre todas las plantas. Los herbicidas totales son frecuentemente herbicidas para los que la diana es enzimas implicadas en las rutas metabólicas vitales de las plantas, lo que les da la ventaja de tener un amplio espectro de actividad sobre plantas de orígenes filogenéticos alejados. Sin embargo, dichos herbicidas tienen también la principal desventaja de actuar también sobre las plantas de cultivo cuando se aplican a los cultivos para eliminar malas hierbas. Esta desventaja puede solventarse al usar plantas para cultivos hechas tolerantes a dichos herbicidas. Dichas plantas se obtienen generalmente por ingeniería genética, introduciendo en su genoma un gen que codifica una enzima resistente a dicho herbicida de manera que sobreexpresen dicha enzima en sus tejidos.

La EPSPS es una enzima de plastidio involucrada en la ruta biosintética del shikimato, llevando a la síntesis de aminoácidos aromáticos. La EPSPS se conoce por ser la enzima diana para herbicidas de la familia de ácidos fosfónicos del tipo fosfonometilglicina. Los herbicidas inhibidores de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) son bien conocidos ya que son herbicidas foliares altamente eficaces. El herbicida mejor conocido de esta clase de herbicidas es glifosato [N-(fosfonometil)glicina]. También se conocen sulfonato o fosametina. El glifosato se caracteriza por una falta de selectividad para las especies de cultivo y se usa, por consiguiente, generalmente bajo condiciones en las que no hay una necesidad de selectividad, por ejemplo como un herbicida total.

Para superar el problema de selectividad del glifosato, las plantas tolerantes a este herbicida se han desarrollado por transformación de dichas plantas con un gen que codifica una enzima EPSPS tolerante al glifosato. Los genes que codifican enzimas EPSPS tolerantes al glifosato se describen en particular en la solicitud de patente EP 0837944. En particular, se vende maíz y soja tolerantes al glifosato respectivamente bajo las marcas Roundup-Ready Corn^TM y Roundup-Ready Soybean^TM. De esta manera, se puede aplicar glifosato a los cultivos sin afectar a las plantas de cultivo que se han hecho tolerantes.

El éxito de esta estrategia se basa esencialmente en la calidad y la cantidad de expresión de la enzima en los tejidos de la planta que se pretende que sea tolerante. Estos parámetros de calidad y cantidad de expresión se controlan por los elementos reguladores introducidos en el casete de expresión con la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha enzima EPSPS. Los elementos reguladores esenciales para un casete de expresión son la secuencia reguladora del promotor y la secuencia reguladora terminal. Los casetes de expresión pueden contener también un péptido señal o un péptido de tránsito, y también un elemento activador o mejorador de la transcripción. Sin embargo, el elemento regulador que contribuye más a la calidad y la cantidad de expresión de una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico en un casete de expresión es el promotor. La identificación del promotor adecuado para expresión de una proteína dada también depende ampliamente de la naturaleza de dicha proteína, y en particular de la cantidad y calidad deseada de la expresión de dicha proteína. Asociado con un promotor dado, es una cantidad de expresión del producto codificado por la secuencia de ácido nucleico que controla, y también una calidad, en particular la calidad espacio-temporal, de esta expresión. Además, algunos promotores son constitutivos y otros inducibles.

Una característica importante para un promotor usado en un casete de expresión destinado a la expresión de una enzima EPSPS en una planta es que pueda permitir una cantidad de expresión cuantitativa suficiente para conferir tolerancia al glifosato en todos los tejidos de la planta que puedan afectarse por este herbicida.

El problema técnico de la presente invención consiste en obtener un casete de expresión en el que el promotor sea particularmente adecuado para la expresión cuantitativa y cualitativa de un enzima EPSPS en plantas transformadas, confiriendo entonces dicho casete de expresión una tolerancia eficaz en dichas plantas, con respecto a un herbicida que inhibe esta enzima, en particular un herbicida de la familia fosfonometilglicina, en particular glifosato.

Los promotores que permiten un alto nivel de expresión son generalmente promotores de proteínas altamente expresadas. Entre los promotores usados más comúnmente que satisfacen estos criterios, puede hacerse mención, por medio del ejemplo, de promotores bacterianos, tal como el del gen de octopina sintasa o el del gen de nopalina sintasa, promotores virales, tal como el del gen que controla la transcripción de los ARN 35S o 19S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), o promotores del virus del mosaico de la vena de yuca (como se describe en la solicitud de patente WO 97/48819). Entre los promotores de origen vegetal, se hará mención del promotor del gen de la sub-unidad pequeña ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (RuBisCO), el promotor de un gen de histona como se describe en la solicitud EP 0 507 698, o el promotor de un gen de actina de arroz (documento US 5.641.876).

Otros promotores se expresan de forma específica en las células de ciertos tejidos. Dichos promotores son generalmente promotores que regulan la expresión de proteínas implicadas en la función de un tejido u órgano particular. En plantas, se conocen promotores específicos de la raíz, tal como, por ejemplo, los descritos en la solicitud de patente WO 00/29594, promotores específicos de la flor, tal como los descritos en las solicitudes de patente WO 98/22593, WO 99/15679 o WO 99/43818, y promotores específicos de la fruta, en particular promotores específicos de la semilla, tal como los descritos en las solicitudes de patente WO 91/13993, WO 92/17580, WO 98/45460, WO 98/45461 o WO 99/16890.

La presente invención se refiere a un nuevo casete de expresión que comprende, en la dirección de transcripción, opcionalmente unido a otro, una secuencia reguladora de promotor que es funcional en células vegetales o plantas, una secuencia de ácido nucleico que codifica 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y una secuencia terminal que es funcional en células vegetales o plantas, caracterizada en que la secuencia reguladora del promotor comprende, en la dirección de transcripción, la secuencia de ácido nucleico x, y, y, z, según el cual x se representa por la SEQ ID NO: 1, y se representa por la SED ID NO: 2, y z se representa por la SEQ ID NO:3.

La expresión "funcionalmente unidos a otro" significa que dichos elementos del gen quimérico están unidos entre sí de tal manera que su función está coordinada y permite la expresión de la secuencia de codificación. A modo de ejemplo, un promotor se une de forma funcional a una secuencia de codificación cuando es capaz de asegurar la expresión de dicha secuencia de codificación. La estructura del gen quimérico según la invención y el montaje de sus diversos elementos puede realizarse usando técnicas bien conocidas de los expertos en la técnica,...

1. Un casete de expresión que comprende, en la dirección de transcripción, funcionalmente unido a otro, una secuencia reguladora del promotor que es funcional en células vegetales o plantas, una secuencia de ácido nucleico que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y una secuencia reguladora terminal que es funcional en células vegetales o plantas, caracterizado en que la secuencia reguladora del promotor comprende, en la dirección de transcripción, las secuencias de ácido nucleico X, Y, Y y Z, según el cual x se representa por la SEQ ID NO: 1, Y se representa por la SEQ ID NO:2, y Z se representa por la SEQ ID NO: 3.

2. El casete de expresión según la reivindicación 1, caracterizado en que la secuencia reguladora del promotor se representa por la SEQ ID NO 5.

3. El casete de expresión según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado en que la secuencia de ácido nucleico que codifica una EPSPS es una secuencia que codifica una EPSPS que ha sido mutada a los aminoácidos que corresponden a la treonina en la posición 102 y la prolina en la posición 106, siendo dichas posiciones relativas con respecto a la secuencia EPSPS de maíz.

4. El casete de expresión según la reivindicación 3, caracterizado en que la secuencia de ácido nucleico que codifica una EPSPS es la secuencia que codifica una EPSPS mutada que comprende una isoleucina en la posición 102 y una serina en la posición 106, siendo dichas posiciones relativas con respecto a la secuencia EPSPS de maíz.

5. El casete de expresión según la reivindicación 4, caracterizado en que la secuencia de ácido nucleico que codifica una EPSPS mutada es la secuencia que codifica una EPSPS mutada de maíz que comprende una isoleucina en la posición 102 y una serina en la posición 106.

6. Los casetes según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados en que además comprende un péptido de transición doble que comprende, en la dirección de transcripción, una secuencia que codifica un péptido de transición de un gen vegetal que codifica una enzima que está situada en plástidos, una parte de la secuencia de la parte N-terminal madura de un gen vegetal que codifica una enzima que está situada en plástidos, y después una secuencia que codifica un segundo péptido de transición de un gen vegetal que codifica una enzima que está situada en plástidos.

7. Un vector de clonado y/o expresión para transformar células vegetales o plantas, caracterizado en que comprende al menos un casete de expresión según una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una célula vegetal transformada, caracterizada en que comprende un casete de expresión según una de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Una planta transformada, caracterizada en que comprende un casete de expresión según una de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Una semilla de planta transformada según la reivindicación 9, caracterizada en que comprende un casete de expresión según la reivindicación 6.

11. Un método para tratar plantas según la reivindicación 9; caracterizado en que dichas plantas se tratan con herbicida que inhibe la EPSPS.

12. El método según la reivindicación 11, caracterizado en que dicho herbicida que inhibe la EPSPS es glifosato.

13. Un método para controlar las malas hierbas en los cultivos, caracterizado en que las plantas transformadas según la reivindicación 9 se hacen crecer, y en que dichas plantas se tratan con un herbicida que inhibe la EPSPS.

14. El método según la reivindicación 13, caracterizado en que dicho herbicida que inhibe la EPSPS es glifosato.

15. Un método para hacer crecer plantas transformadas según la reivindicación 9, caracterizado en que consiste en plantar semillas de dichas plantas transformadas en un área de campo adecuado para hacer crecer dichas plantas, en aplicar a dicha área de dicho campo una composición agroquímica, que no afecte sustancialmente dichas semillas transformadas o dichas plantas transformadas, y luego cosechar las plantas crecidas cuando alcancen la madurez deseada y, opcionalmente, separar las semillas de las plantas cosechadas.