PLANTAS TRANSFORMADAS CON BIOSÍNTESIS DE PRENILQUINONAS MEJORADA.

Plantas transformadas caracterizadas porque comprenden:

(1) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima prefenato deshidrogenasa (PDH),

con la excepción de la secuencia que codifica del gen TyrA de Erwinia herbicola, (2) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima piruvato de p-hidroxifenilo dioxigenasa (HPPD).

Plantas transformadas con biosíntesis de prenilquinonas mejorada La presente invención se refiere a plantas transformadas, en particular a plantas transformadas que producen cantidades mayores de plastoquinonas, tocotrienoles y tocoferoles que las plantas idénticas no transformadas. Esta invención se refiere igualmente a un procedimiento de producción de estas plantas, así como a un procedimiento de cultivo de estas plantas. Las plantas según la invención tienen igualmente la propiedad de ser tolerantes a herbicidas inhibidores de la enzima piruvato de p-hidroxifenilo dioxigenasa (denominada de aquí en adelante HPPD) .

Las prenilquinonas son un amplio grupo de compuestos con afinidades lipídicas que comprenden, entre otros, plastoquinonas, tocoferoles y tocotrienoles. En las plantas, las prenilquinonas se sintetizan por la ruta del homogentisato.

La prenilquinona más conocida es la vitamina E o a-tocoferol, elemento esencial de la alimentación humana y animal, en particular de la de mamíferos que no la producen naturalmente, pero que tienen una necesidad alimentaria de ella. El efecto más reconocido de la vitamina E es su acción antioxidante sobre los lípidos de las membranas celulares (Epstein et al., 1966, Radical Research 28: 322-335; Kamel-Eldin y Appelqvist, 1996, Lipids 31: 671-701) .

Más allá de la vitamina E, se ha demostrado que los tocotrienoles, aunque no esenciales en la alimentación humana y animal, poseen propiedades antioxidantes particularmente interesantes, mayores que las de la vitamina E (Kamat et al., 1997, Mol. Cell. Biochem. 170, 131-137) . Estos compuestos son especialmente conocidos por proteger a las células contra los radicales libres, así como por prevenir la aparición de enfermedades cardiovasculares o cánceres (Packer et al., 2001, J. Nutr. 131 (2) : 369S-373S) . Además, los tocotrienoles presentan una actividad anticancerosa por la inhibición de la proliferación de los receptores de estrógenos, actividad que no poseen los tocoferoles (Guthrie et al., 1997, J. Nutr.

127: 544-548) . Presentan igualmente una actividad hipocolesterolémica bastante mejor que los tocoferoles (Pearce et al., 1992, J. Med. Chem. 35: 3595-3606; Qureshi et al., 2001, J. Nutr. 131: 2606-2618) , lo que las hace más aptas para luchar contra la arteriosclerosis.

Las plastoquinonas no tienen un papel conocido en la salud humana o animal, pero desempeñan un papel clave en las plantas. Estas moléculas están presentes en las membranas de cloroplastos y tienen como función el transporte de electrones a lo largo de la reacción de fotosíntesis (Grumbach, 1984, “Structure Function and Metabolisme of plant lipids”, Siegenthaler and Eichenberger eds) .

Además, un aumento de la cantidad de prenilquinonas debería conferir a las plantas una mejor resistencia frente a los estreses oxidativos, en particular frío, sequía o una iluminación fuerte.

En las plantas y los organismos fotosintéticos en general, el homogentisato constituye el precursor aromático de las prenilquinonas. El homogentisato es el producto de la enzima piruvato de p-hidroxifenilo dioxigenasa (denominada de aquí en adelante HPPD) . En la mayoría de organismos, las HPPD son enzimas implicadas en la ruta de degradación catabólica del aminoácido aromático tirosina (Goodwin, 1972, en “Tyrosine Metabolism: The biochemical, physiological, and clinical significance of p-hydroxyphenylpyruvate oxygenase”, Goodwin B.L., ed., Oxford University Press, 1-94) . Las HPPD catalizan la reacción de transformación de piruvato de para-hidroxifenilo (HPP) , producto de degradación de la tirosina, en homogentisato.

La mayoría de las plantas sintetizan la tirosina a través del arogenato (Abou-Zeid et al. 1995 Applied Env. Microb. 41: 1298-1302, ; Bonner et al., 1995 Plant Cells Physiol. 36, 1013-1022; Byng et al., 1981 Phytochemistr y 6: 1289-1292; Connely y Conn 1986 Z. Naturforsch 41c: 69-78; Gaines et al., 1982 Planta 156: 233-240) . En estas plantas, el HPP deriva únicamente de la degradación de la tirosina. En contraposición, en organismos como la levadura Sacharomyces cerevisiae o la bacteria Escherichia coli, el HPP es un precursor de tirosina y se sintetiza mediante la acción de una enzima prefenato deshidrogenasa (de aquí en adelante PDH) que transforma el prefenato en HPP (Lingens et al., 1967 European J. Biochem 1: 363-374; Sampathkumar y Morrisson 1982 Bioch. Biophys. Acta 702: 204-211) . En estos organismos, la producción de HPP está ligada por tanto directamente a la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (ruta del shikimato) y no a la ruta de degradación de tirosina (véase la Figura 1) .

Con el fin de aumentar la biosíntesis de prenilquinonas por plantas, los inventores de la presente publicación de patente han intentado aumentar el flujo del precursor HPP en las células de estas plantas conectando la síntesis de dicho precursor con la ruta denominada del shikimato mediante la sobreexpresión de una enzima PDH. El efecto esperado es un flujo mayor del precursor HPP que debe aumentar globalmente la biosíntesis de prenilquinonas Se ha comprobado efectivamente que la transformación de plantas con un gen que codifica una enzima PDH permite aumentar la producción de prenilquinonas por dichas plantas. Este aumento es muy significativo cuando las plantas transformadas con un gen que codifica un enzima PDH son plantas que sobreexpresan igualmente una enzima HPPD. Se realiza una comprobación similar en el documento WO 02/089561 con la enzima PDH codificada por el gen TyrA de Erwinia herbicola.

Se ha comprobado igualmente que la transformación de plantas con un gen que codifica una enzima PDH permitía aumentar la tolerancia de dichas plantas a los inhibidores de HPPD. Este aumento de tolerancia es muy significativo cuando las plantas transformadas con un gen que codifica una enzima PDH son plantas que sobreexpresan igualmente una enzima HPPD.

Desde hace varios años, ha crecido considerablemente el interés por las HPPD a causa de la demostración de que esta enzima es la diana de nuevas familias de herbicidas llamados “blanqueantes”. Dichos herbicidas que tienen como diana HPPD son especialmente isoxazoles (documentos EP 418.175, EP 470.856, EP 487.352, EP 527.036, EP 560.482, EP 682.659, US 5.424.276) en particular isoxaflutol, herbicida selectivo de maíz, dicetonitrilos (documentos EP 496.630, EP 496.631) , en particular 2-ciano-3-ciclopropil-1- (2-SO2CH3-4-CF3-fenil) propano-1, 3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1- (2SO2CH3-4-2, 3Cl2-fenil) propano-1, 3-diona, tricetonas (documentos EP 625.505, EP 625.508, US 5.506.195) , en particular sulcotriona o mesotriona, o también pirazolinatos.

Una de las ventajas de los herbicidas que tienen como diana enzimas implicadas en las rutas metabólicas vitales de las plantas es su amplio espectro de actividad sobre plantas de orígenes filogenéticos alejados. Sin embargo, dichos herbicidas presentan igualmente el inconveniente principal, cuando se aplican sobre cultivos para eliminar los vegetales indeseables o “malas hierbas”, de actuar igualmente sobre las plantas cultivadas. Este inconveniente puede paliarse mediante la utilización de plantas cultivadas tolerantes a dichos herbicidas. Dichas plantas se obtienen generalmente mediante ingeniería genética introduciendo en su genoma un gen que codifica una enzima de resistencia a dicho herbicida de manera que sobreexpresen dicha enzima en sus tejidos.

Hasta ahora, se han empleado tres estrategias principales que utilizan la ingeniería genética para volver las plantas tolerantes a herbicidas. La primera consiste en detoxificar el herbicida mediante la transformación de la planta con un gen que codifica una enzima de detoxificación. Esta enzima transforma el herbicida, o su metabolito activo, en productos de degradación no tóxicos, como por ejemplo las enzimas de tolerancia de bromoxinilo o basta (documentos EP 242.236, EP 337.899) . La segunda estrategia consiste en transformar la planta con un gen que codifica la enzima diana mutada de manera que sea menos sensible al herbicida, o a su metabolito activo, como por ejemplo las enzimas de tolerancia a glifosato (documentos EP 293.356; Padgette et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 33) . La tercera estrategia consiste en sobreexpresar la enzima diana sensible, de manera que se produzcan en la planta cantidades elevadas de la enzima diana, si es posible muy superiores a la cantidad de herbicida que penetra en la planta. Esta estrategia permite mantener un nivel suficiente de enzima funcional a pesar de la presencia de su inhibidor.

Se ha... [Seguir leyendo]

1. Plantas transformadas caracterizadas porque comprenden:

(1) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima prefenato deshidrogenasa (PDH) , con la excepción de la secuencia que codifica del gen TyrA de Erwinia herbicola, (2) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima piruvato de p-hidroxifenilo dioxigenasa (HPPD) .

2. Células vegetales transformadas, caracterizadas porque comprenden:

(1) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima PDH, con la excepción de la secuencia que codifica del gen TyrA de Erwinia herbicola, (2) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima HPPD.

3. Plantas según la reivindicación 1, o células vegetales según la reivindicación 2, caracterizadas porque la secuencia que codifica una enzima PDH es la secuencia que codifica un gen que codifica una PDH de levadura.

4. Plantas o células vegetales según la reivindicación 3, caracterizadas porque la secuencia que codifica un gen que 15 codifica una PDH de levadura es la secuencia que codifica un gen de Saccharomyces cereviseae.

5. Plantas o células vegetales según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque la secuencia que codifica una enzima HPPD es la secuencia que codifica un gen que codifica una HPPD de planta.

6. Plantas o células vegetales según la reivindicación 5, caracterizadas porque la secuencia que codifica un gen que codifica una HPPD de planta es la secuencia que codifica un gen de Arabidopsis thaliana.

20 7. Procedimiento de cultivo de plantas transformadas según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque consiste en plantar los granos de dichas plantas transformadas en una superficie de un campo apropiado para el cultivo de dichas plantas, en aplicar sobre dicha superficie de dicho campo al menos una composición herbicida que comprende un inhibidor de HPPD y después en recoger las plantas cultivadas cuando llegan a la madurez deseada, y eventualmente en separar los granos de las plantas recogidas.

25 8. Procedimiento para conferir a plantas tolerancia a inhibidores de HPPD, caracterizado porque se transforman dichas plantas, simultánea o sucesivamente, con:

(1) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima PDH,

(2) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima 30 HPPD.

9. Procedimiento para aumentar la cantidad de prenilquinonas en plantas, caracterizado porque se transforman dichas plantas, simultánea o sucesivamente, con:

(1) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima PDH, con la excepción de la secuencia que codifica el gen TyrA de Erwinia herbicola, (2) un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima HPPD.

10. Procedimiento de producción de prenilquinonas, caracterizado porque comprende una etapa de puesta en cultivo de una célula vegetal o de una planta transformada según una de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio de cultivo adaptado al crecimiento y la multiplicación de dicha célula vegetal o de dicha planta.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque las prenilquinonas son tocotrienoles.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque las prenilquinonas se representan por la vitamina E.

13. Plantas o células vegetales según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas porque comprenden, además,

45 un gen quimérico que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima geranilgeranilo reductasa (GGR) .

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque se transforman dichas plantas, simultánea o sucesivamente, con un gen quimérico además que comprende un promotor funcional en plantas y una secuencia que codifica una enzima GGR.