BUTINOL 1 ESTERASA.

Proteína con actividad butinol I esterasa, que comprende por lo menos una secuencia parcial de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO:

3, 4, 5 ó 6, que tiene la facultad para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos

Butinol 1 esterasa.

La presente invención se refiere a proteínas novedosas de Pseudomonas glumae, que tienen una actividad esterasa, en particular una actividad butinol 1 esterasa, a secuencias de ácido nucleico que las codifican, a casetes de expresión, vectores y microorganismos recombinantes; a métodos para preparar tales proteínas y al uso de las mismas para la hidrólisis enzimática de éster, en particular enzimática enantioselectiva, o bien transesterificación de ésteres orgánicos.

Las esterasas y las lipasas son hidrolasas que pueden ser empleadas en procesos industriales para sintetizar compuestos orgánicos ópticamente activos y que son caracterizadas por alta especificidad para sustrato. A través de un mecanismo similar al mecanismo de serina proteasas, puede transferir grupos acilo a nucleófilos, como por ejemplo grupos carbonilo, o bien disociar hidrolíticamente enlaces éster. Las esterasas, lipasas y serina proteasas comparten la triada catalítica, un motivo de secuencia que consiste de los aminoácidos Ser, His y Asp, en donde el átomo de carbono de carbonilo es sometido a ataque nucleofílico por el Ser activo, que, con participación de los demás dos aminoácidos lleva a una distribución de carga. Las esterasas y lipasas pueden también transferir grupos acilo a otros nucleófilos, como por ejemplo grupos tio de un éter tio o aminas activadas.

Las lipasas hidrolizan los ésteres de glicerina de cadena larga y se caracterizan por activación superficial, es decir, el sitio activo se vuelve accesible solamente en presencia de sustrato de lípidos. Las lipasas son estables en solventes orgánicos no acuosos y se emplean en numerosos procesos industriales para resolución cinética de racemato, es decir, un enantiómero es convertido sustancialmente más rápidamente que el otro. Dicho enantiómero puede ser obtenido a continuación a de la solución de reacción debido a propiedades físicas y químicas diferentes.

Nakamura (Nakamura, K y colaboradores, Tetrahedron; Asymmetry 9, (1999), 4429-4439) describe la resolución de racemato de 1-alquin-3-ol por transesterificación en solventes hidrofóbicos con ayuda de lipasas comercialmente disponibles (Amano AK, AH y PS; Amano Pharmaceuticals Co. Ltd.). En esta reacción, la enantioselectividad se eleva con la longitud de cadena del donador de acilo y residuos estéricamente grandes (acetato de cloro, benzoato de vinilo) tienen un efecto negativo sobre la reacción. Yang (Yang, H. y colaboradores, J. Org. Chem. 64, (1999), 1709-1712) describe la preparación enantioselectiva de ácidos ópticamente activos por transesterificación con ésteres de vinilo empleando lipasa B de Cándida antártica como catalizador. En este caso, los ésteres de etilo llevan a una velocidad de reacción claramente más baja y a una menor selectividad. Una lipasa aislada de Burkholderia plantarii (Pseudomonas plantarii o glumae) DSM 6535 se emplea para la acilación enantioselectiva de aminas racémicas con ayuda de etil metoxi-acetato (Balkenhohl, F. y colaboradores J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384).

Las esterasas catalizan enantioselectivamente la formación y ruptura de enlaces éster (reacción directa y reversa). Se prefiere utilizar los ésteres de vinilo en la transesterificación para obtener alcoholes ópticamente activos, puesto que la función alcohol del éster ya no está disponible después de la conversión debido a la tautomerización del aldehído o cetona y por consiguiente se puede evitar la reacción reversa. En contraste a las lipasas, las esterasas no son activadas superficialmente y convierten también los compuestos orgánicos de cadena relativamente corta. Esterasas de especificidad para sustrato diferente han sido aisladas de varios organismos.

Así, la esterasa de Pseudocardia thermophila FERM-BP-6273 se utiliza para hidrolizar ésteres cromano-acéticos ópticamente activos (EP-A-O 892 044).

Una esterasa de Bacillus acidocaldarius hidroliza ésteres de baja enantioselectividad de un rango estrecho de sustratos (Manco, G. y colaboradores, Biochem. J. 332, (1998), 203-212).

La acilasa 1 de Aspergillus se emplea para obtener alcoholes secundarios por transesterificación con ésteres de vinilo en solventes orgánicos no polares, y se prefiere la conversión de alcoholes secundarios que tienen cadenas laterales cortas (Faraldos, J. y colaboradores, Synlett 4, (1997), 367-370). A partir de Pseudomonas fluorescens DSM 50 106 se ha clonado una esterasa específica para lactona unida a membrana (Khalameyzer, V. y colaboradores, Appl. y Environ. Microbiol. 65 (2), (1999), 477-482), y a partir del mutante Q de E. coli una acetilesterasa (Peist, R. y colaboradores, J. Bacteriol. 179, (1997), 7679-7686). Sin embargo, la enantioselectividad y la especificidad para sustrato de estas dos esterasas no han sido estudiadas con más detalles. Rhodococcus sp. NCBM 11216 expresa 4 esterasas, RR1 a RR4, que tienen una especificidad diferente. Para la síntesis de éster a partir de un naftol y un ácido, RRl y RR2 prefieren ácidos con cadenas de carbono cortas, mientras que RR3 y RR4 convierten específicamente ácidos que tienen cadenas de carbono relativamente largas y residuos estéricamente relativamente grandes (Gudelj, M. y colaboradores, J. Mol. Cat. B, Enzymatic 5, (1998), 261-266).

Krebsfänger, N. y colaboradores, describen en Enyzme Microb. Technol., 1998, V. 2, 641-646 el aislamiento de una esterasa a partir de Pseudomonas fluorescens.

Sin embargo, esterasas que tienen una amplia gama de sustratos y una alta enantioselectividad y que pueden emplearse en procesos industriales no están disponibles para preparar pequeñas moléculas orgánicas, como por ejemplo alcoholes ópticamente activos, ácidos o ésteres con cadenas de carbono cortas. Es un objeto de la presente invención el suministro de esterasas que tienen por lo menos una de las propiedades mencionadas arriba.

Este objeto se resuelve, sorprendentemente, proporcionando una proteína que tiene actividad butinol I esterasa, que abarca por lo menos una secuencia de parte de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: ID NO: 3, 4, 5 ó 6:

(cada una proporcionada en el código de una letra para aminoácidos, el primer aminoácido en cada caso corresponde al extremo amino-terminal respectivo),

El objeto se logró en particular proporcionando una butinol I esterasa según la reivindicación 2 que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 2 25 o bien que es codificada por una secuencia de ácido nucleico de conformidad con SEQ ID NO: 1.

Para mayor simplicidad, de aquí en adelante las proteínas mencionadas arriba se denominan butinol I esterasas.

Los "equivalentes funcionales" o análogos de los polipéptidos o proteínas divulgados específicamente son para propósitos de la presente invención polipéptidos o proteínas que difieren de ellos pero siguen teniendo la actividad enzimática definida en las reivindicaciones de patente, así como las características estructurales definidas en las reivindicaciones de patente.

Tales "equivalentes funcionales" de conformidad con la presente invención se refieren particularmente a mutantes que tienen en por lo menos una de las posiciones de secuencia de SEQ ID NO:2 un aminoácido que difiere del aminoácido específicamente mencionado pero sin embargo tiene por lo menos una de las actividades biológicas de la invención. Los "equivalentes funcionales" comprenden por consiguiente los mutantes disponibles por uno o más adiciones, sustituciones, deleciones y/o inversiones de aminoácidos, y es posible que tales modificaciones ocurran en cualquier posición de secuencia en la medida en que llevan a un mutante que tiene el perfil de propiedades de la inversión. Una equivalencia funcional existe en particular también cuando existe una correlación cualitativa entre el mutante y un polipéptido no modificado en el patrón de reactividad, es decir, existen diferencias...

1. Proteína con actividad butinol I esterasa, que comprende por lo menos una secuencia parcial de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 3, 4, 5 ó 6, que tiene la facultad para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.

2. Proteína con actividad butinol I esterasa que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma, con un grado de homología de al menos 60% calculado según el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448, la cual tiene la facultad para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.

3. Proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes que comprende una cadena polipeptídica con un peso molecular de aproximadamente 41300 Da.

4. Proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque puede obtenerse a partir de Pseudomonas glumae Lu 2023 con número de depósito DSM 13176.

5. Proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque adicionalmente cataliza por lo menos una de las reacciones siguientes:

a) hidrólisis enantioselectiva de ésteres ópticamente activos de la fórmula I

(I)R¹-COO-R²

en donde

R¹ es un alquilo C₁-C₁₀, alquenilo C₂-C₁₀, alquinilo C₂-C₁₀, de cadena recta o ramificada, insustituido o monosustituido o polisustituido y R² es un alquilo C₁-C₁₀, alquenilo C₂-C₁₀, alquinilo C₂-C₁₀, aralquilo C₇-C₁₅, de cadena recta o ramificado, insustituido o monosustituido o polisustituido o un radical aromático mononuclear o polinuclear, insustituido o monosustituido o polisustituido,

R¹ y/o R² comprenden por lo menos un átomo de carbono asimétrico; y

b) transesterificación enantioselectiva de un éster de la fórmula 1 con un alcohol ópticamente activo

de la fórmula II

R²-OH (II),

en donde R² tiene uno de los significados antes mencionados y, opcionalmente, tiene por lo menos un átomo de carbono asimétrico.

6. Polinucleótido, que codifica para una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, y las secuencias que la hibridan en condiciones estrictas o complementarias a la misma, que comprende respectivamente una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30 residuos de nucleótidos sucesivos en una secuencia de ácido nucleico de conformidad con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma de al menos 30 residuos de nucleótidos sucesivos.

7. Casete de expresión que comprende por lo menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6 operativamente enlazado a por lo menos una secuencia reguladora de ácido nucleico.

8. Vector recombinante para transformar un huésped eucariótico o procariótico, que comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, o un casete de expresión de conformidad con la reivindicación 7.

9. Método para preparar una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un microorganismo que produce la proteína de manera endógena o un microorganismo transformado con un vector de conformidad con la reivindicación 8 es cultivado y la proteína es aislada del cultivo.

10. Método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el microorganismo es pseudomonas glumae Lu 2023 con número de depósito DSM 13176.

11. Proteína que puede ser obtenida de conformidad con un método según la reivindicación 9 ó 10, que comprende al menos una secuencia parcial de aminoácidos según SEQID NO: 3, 4, 5 ó 6, la cual está facultada para la hidrólisis enantioselectiva de ésteres butinilo de ácidos carboxílicos.

12. Pseudomonas glumae Lu 2023 con número de depósito DSM 13176 y variantes y mutantes del mismo.

13. Microorganismo caracterizado porque lleva un vector de conformidad con la reivindicación 8.

14. Método para la hidrólisis enantioselectiva de éster utilizando una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde

a) la proteína se pone en contacto con una mezcla de estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la fórmula I; y

b) los compuestos ópticamente activos que provienen de la hidrólisis estereoselectiva de uno de los estereoisómeros y/o el enantiómero de éster no hidrolizado se obtienen a partir del medio de la reacción.

15. Un método para la transesterificación enantioselectiva, en donde

a) una mezcla de estereoisómeros de un alcohol ópticamente activo de la fórmula II se pone en contacto con un éster de la fórmula I en presencia de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 5 y el estereoisómero de alcohol sin reaccionar es obtenido del medio de la reacción; o

b) una mezcla de estereoisómeros de un éster ópticamente activo de la fórmula I se pone en contacto con un alcohol de la fórmula II en presencia de una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5 y un estereoisómero del alcohol ópticamente activo contenido en el éster es obtenido a partir del medio de la reacción.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, en donde un éster de vinilo se utiliza para la transesterificación como agente de acilación para un alcohol ópticamente activo.

17. Un método de conformidad con una de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, en donde el medio de la reacción utilizado es un solvente orgánico.