Brushita como sistema de inmovilización de enzimas y su uso en biosensores amperométricos biocompatibles.

La presente invención se refiere a un nuevo sistema de inmovilización enzimático que utiliza un material inorgánico biocompatible (Brushita, un cemento fraguado de fosfato cálcico) como matriz para la adsorción de enzimas y a un biosensor amperométrico preparado con dicho sistema de inmovilización. Comprende el procedimiento de fabricación del biosensor y su aplicación en medios acuosos y predominantemente orgánicos.

En el proceso de fabricación del biosensor, primero se deposita una mezcla brushita-enzima sobre la superficie electródica y se deja secar al aire, a temperatura ambiente. Posteriormente se procede a la reticulación intermolecular del enzima adsorbido a la matriz, manteniendo el electrodo modificado en vapor de glutaraldehido. El biosensor resultante se utiliza para la determinación de analitos en disolventes acuosos y medios predominantemente orgánicos

Brushita como sistema de inmovilización de enzimas y su uso en biosensores amperométricos biocompatibles.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo sistema de inmovilización enzimático que utiliza un material inorgánico biocompatible (Brushita, un cemento fraguado de fosfato cálcico) como matriz para la adsorción de enzimas, y a un biosensor para la determinación de analitos en medios acuosos y no acuosos basado en un sistema de inmovilización de enzimas sobre brushita.

Estado de la técnica

Los biosensores constan de un transductor y un material biológico y uno de los aspectos más relevantes en la aplicabilidad de un biosensor es el tipo y calidad del material biológico. En este sentido se han propuesto distintos sistemas de inmovilización, entre ellos la adsorción de las biomoléculas sobre distintos materiales. Se trata de un método sencillo que consiste en poner en contacto las moléculas de enzima con el material adsorbente durante el tiempo suficiente para que se produzcan las interacciones entre la biomolécula y la matriz.

En la patente FR 2667077 se detalla el proceso de inmovilización de una proteína, preferentemente una enzima, por adsorción en un soporte sólido de un electrodo (vidrio, metal, polímero, componente de tela, fibra óptica, etc.) y posterior reticulación por vaporización de un agente reticulante (glutaraldehído) por pulverización, para hacer más estable la enzima. En esta patente se reivindica también un biosensor que utiliza un electrodo enzimático obtenido a través de este proceso de inmovilización para la determinación de analitos en disoluciones acuosas que presenta tiempos de respuesta cortos (del orden de 5-10 segundos).

Se han descrito distintos biosensores enzimáticos amperométricos que utilizan como soporte para la adsorción de la enzima matrices inorgánicas como arcillas del tipo laponita (Cosnier and col., Mater. Sci. Eng., C., 2006, 26, 442-447; Li and Hu., J. Electroanal. Chem., 2003, 558, 155-165) e hidróxidos de doble capa (Mousty et al., Biosens. Bioelectron., 2007, 22, 1733-1738), nanopartículas de carbonato cálcico (Shan et al., Biosens. Bioelectron., 2007., 22, 1612-1617), nanopartículas de oro (Zhang et al., Biosens. Bioelectron., 2005, 21, 337- 345), nanotubos de carbono (Zhao et al., Electrochem. Commun., 2003, 5, 825-829) e híbridos de nanopartículas de oro con nanotubos de carbono (Chen et al., Biosens. Bioelectron., 2007, 22, 1268-1274) utilizándose para la determinación de analitos en medios acuosos. Entre las ventajas más importantes de estos biosensores destacan, en algunos casos, la biocompatibilidad de las matrices de inmovilización, en otros la conductividad eléctrica de los materiales utilizados, en otros la estabilidad de los biosensores y en otros su sencilla fabricación.

En los últimos años se han desarrollado los llamados biosensores de fase orgánica, que son dispositivos capaces de trabajar en disolventes orgánicos, pudiéndose utilizar para la determinación de analitos en muestras de muy distinta naturaleza y ampliando así el campo de aplicación de los biosensores (Sánchez-Paniagua et al., 2006., Biomol. Eng, 23, 135-147; Sánchez-Paniagua et al., Biosens. Bioelectron., 2006, 21, 2320-2328).

La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un nuevo sistema de inmovilización enzimático que combina adsorción y entrecruzamiento y utiliza como matriz para la adsorción de enzimas un material inorgánico la brushita (cemento fraguado de fosfato cálcico) que es biocompatible (Kumta et al., Acta Biomater., 2005., 1, 65-83) y posee, además, características de electrolito sólido (Tortet y col., J. Solid State Chem., 1997., 132, 6-16). Así mismo se refiere a un biosensor amperometrico cuyo componente biológico consiste en uno o más enzimas inmovilizadas en dicha matriz, para la determinación de analitos en medios acuosos y predominantemente orgánicos.

Las aportaciones más importantes de este nuevo dispositivo combinan la sencilla y rápida fabricación del biosensor como consecuencia de la inmovilización por adsorción, la ampliación del campo de aplicación del biosensor a estudios "in vivo", como consecuencia de utilizar una matriz biocompatible, así como a muestras de naturaleza hidrofóbica, ya que permite realizar medidas en medios no acuosos, y a la determinación de analitos a niveles traza por la elevada sensibilidad de estos dispositivos.

Descripción de la invención

Brushita como sistema de inmovilización de enzimas y su uso en biosensores amperométricos biocompatibles.

La presente invención se refiere a un nuevo sistema de inmovilización enzimático que utiliza un material inorgánico biocompatible (Brushita, un cemento fraguado de fosfato cálcico) como matriz para la adsorción de enzimas, y a un biosensor amperométrico basado en dicho sistema de inmovilización. Comprende el procedimiento de fabricación del biosensor y su aplicación en medios acuosos y predominantemente orgánicos.

La fabricación del biosensor es un proceso sencillo que requiere los siguientes pasos: (1) adsorción de la enzima en la brushita y (2) entrecruzamiento intermolecular enzimático con un agente entrecruzante. En primer lugar, se deposita una mezcla brushita-enzima sobre la superficie de un electrodo y se deja secar al aire, a temperatura ambiente. El electrodo modificado se mantiene en vapor de glutaraldehido para llevar a cabo la reticulación enzimática, que evita en gran medida la pérdida de enzima aumentando la estabilidad del biosensor. En la Figura 1 se muestra una micrografía de la superficie electródica después de producirse la adsorción y reticulación enzimática, observándose pequeñas partículas en buen contacto con la superficie del metal.

El material biológico que se encuentra inmovilizado en brushita puede ser una o más enzimas oxidorreductasas. Para el entrecruzamiento químico se puede utilizar cualquier reactivo polifuncional que sirva como agente reticulante enzimático. El tipo de electrodo (transductor) utilizado dependerá del analito a determinar.

La proporción enzima-brushita en la mezcla puede variar entre 0,25 y 1,5; la cantidad de mezcla enzima-brushita depositada en la superficie electródica de área 0,07 cm², puede variar entre 12,5 µg-100 µg y tiempo de entrecruzamiento enzimático entre 5 y 25 minutos.

La determinación de los analitos con el biosensor propuesto se lleva a cabo mediante amperometría, en agitación constante, en una celda electroquímica termostatizada, que contiene el biosensor, un electrodo auxiliar y un electrodo de referencia, manteniendo el biosensor al potencial adecuado constante. Como consecuencia de la reacción entre la enzima inmovilizada y el analito, se produce la transformación química del sustrato. En la superficie del electrodo de trabajo (biosensor) tiene lugar la reacción redox de alguna de las especies que participan en la reacción enzimática, generándose una intensidad de corriente que estará relacionada con el analito presente en la muestra. El biosensor resultante permite la determinación de analitos en disolventes acuosos y medios predominantemente orgánicos.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la micrografía de las muestras tirosinasa/brushita con entrecruzamiento con glutaraldehido sobre una superficie metálica.

La Figura 2 muestra la curva de calibrado de catecol en medio acuoso obtenida con el biosensor de tirosinasa/brushita en disoluciones tampón fosfato 0,1 M pH 6,0.

La Figura 3 muestra las curvas de calibrado de catecol en medios predominantemente orgánicos obtenidas con el biosensor de tirosinasa/brushita en mezclas de disolvente orgánico:tampón (98,5:1,5): (a) etanol:tampón y (b) acetonitrilo:tampón.

La Figura 4 muestra la estabilidad del biosensor propuesto en (a) medio acuoso y (b) mezclas acetonitrilo:tampón (98,5:1,5).

Modo de realización de la invención

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance.

Ejemplo 1

Preparación de biosensor de tirosinasa inmovilizada en brushita sobre un electrodo de carbón vitrificado

Para la fabricación del biosensor se prepara una suspensión de cemento de brushita (2 mg mL^-1) por dispersión en agua desionizada mediante agitación durante, al menos, 12 horas y una disolución de enzima (2 mg mL^-1) en...

1. Material biológico con enzima inmovilizada en su interior caracterizado porque contiene una o varias enzimas adsorbidas en brushita.

2. Material biológico con enzima inmovilizada, según reivindicación 1, caracterizado porque las enzimas son oxidorreductasas.

3. Método de obtención del material biológico con enzima inmovilizada descrito en las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (a) adsorción del enzima a brushita y (b) reticulación intermolecular del enzima por vapor de glutaraldehído.

4. Uso del material biológico con enzima inmovilizada, según reivindicación 1, como parte de un biosensor.

5. Uso del material biológico con enzima inmovilizada, según reivindicación 4, donde el biosensor realiza medidas amperométricas en disoluciones por agitación constante.

6. Uso del material biológico con enzima inmovilizada, según reivindicaciones 4 y 5, donde el biosensor consta de un electrodo en cuya superficie se deposita una mezcla de enzima- brushita.

7. Uso del material biológico con enzima inmovilizada, según reivindicaciones 4, 5 y 6, donde el biosensor determina analitos en medios acuosos.

8. Uso del material biológico con enzima inmovilizada, según reivindicaciones 4, 5 y 6, donde el biosensor determina analitos en medios predominantemente orgánicos.