Biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión,

comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo péptido, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el receptor transferrina (TfR)

Bibliotecas de proteínas de fusión de la transferrina.

Solicitudes relacionadas

La presente invención reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/485.404, presentada el 9 de julio de 2003, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 10/384.060, presentada el 10 de marzo de 2003, y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 60/406.997 presentada el 30 de agosto de 2002.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a bibliotecas de fagos que contienen proteínas o péptidos con estabilidad en suero y/o semivida circulatoria in vivo ampliadas, particularmente a proteínas o péptidos fusionados a o insertados en una molécula de transferrina modificada para reducir o inhibir la unión al receptor de la transferrina.

Antecedentes de la invención

Las proteínas o péptidos terapéuticos en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante son moléculas típicamente lábiles que presentan cortos periodos de estabilidad en suero o cortas semividas circulatorias in vivo. Adicionalmente, estas moléculas son a menudo extremadamente lábiles cuando están en una formulación, particularmente cuando se formulan en disoluciones acuosas con objetivos diagnósticos y terapéuticos.

Existen pocas soluciones prácticas para prolongar o potenciar la estabilidad in vivo o in vitro de las moléculas proteináceas terapéuticas. Polietilenglicol (PEG) es una sustancia que se puede unir a una proteína, dando como resultado una actividad sostenida, de mayor duración, de la proteína. Si la actividad de la proteína se prolonga mediante la unión a PEG, se puede disminuir la frecuencia en la que se necesita administrar la proteína. La unión a PEG, sin embargo, a menudo disminuye o destruye la actividad terapéutica de la proteína. Aunque en algún caso la unión a PEG puede reducir la inmunogenicidad de la proteína, en otros ejemplos puede aumentar la inmunogenicidad.

Las proteínas o péptidos terapéuticos se han estabilizado también mediante fusión a una proteína capaz de prolongar la semivida circulatoria in vivo de la proteína terapéutica. Por ejemplo, las proteínas terapéuticas fusionadas a albúmina o a fragmentos de anticuerpos pueden presentar semivida circulatoria extendida in vivo en comparación con la proteína terapéutica en el estado no fusionado. Véanse las Patentes de los Estados Unidos 5.876.969 y 5.766.883.

Otra proteína sérica, la transferrina humana glicosilada (Tf), se ha usado para realizar fusiones con proteínas terapéuticas para dirigir la administración hacia el interior de las células o para trasportar agentes a través de la barrera hematoencefálica. Estas proteínas de fusión que comprenden la Tf humana glicosilada se han usado para dirigir el factor de crecimiento nervioso (NGF) o el factor neurotrófico ciliar (CNTF) a través de la barrera hematoencefálica fusionando la Tf de longitud completa con el agente. Véanse las Patentes de los Estados Unidos 5.672.683 y 5.977.307. En estas proteínas de fusión, la porción Tf de la molécula está glicosilada y se une a dos átomos de hierro, que son necesarios para la unión de la Tf con su receptor en una célula y, según los inventores de estas patentes, para dirigir la administración del resto NGF o el CNTF a través de la barrera hematoencefálica. Park y col (Journal of Drug Targeting Vol 6, Nº 1 pp 53-64) exploran la capacidad de usar fusiones genéticas o transferrina como vehículo para la dirección y la administración en el cerebro. Se han producido también proteínas de fusión de la transferrina insertando una secuencia diana de la proteasa de VIH-1 en los bucles expuestos a la superficie de la transferrina glicosilada para investigar la capacidad de producir otra forma de la Tf de fusión para la dirigir la administración al interior de una célula mediante el receptor de Tf (Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34): 24066-24073). Véase también Shin y col (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp 2820-2824).

La transferrina sérica (Tf) es una glicoproteína monomérica con un peso molecular de 80.000 dalton que se une al hierro en la circulación y trasporta esto a diverso tejidos mediante el receptor de la transferrina (TfR) (Aisen y col. (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 357-393; MacGillivray y col. (1981) J. Biol. Chem. 258: 3543-3553, Patente de los Estados Unidos 5.026.651). Tf es una de las moléculas séricas más comunes, que comprende hasta aproximadamente un 5-10% de las proteínas séricas totales. Se produce transferrina deficiente en carbohidratos en grandes cantidades en la sangre de individuos alcohólicos y presenta una semivida más larga (aproximadamente 14-17 días) que la de la transferrina glicosilada) (aproximadamente 7-10 días) Véanse van Eijk y col. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 167-171, Stibler (1991) Clin. Chem. 37: 2029-2037 (1991), Arndt (2001) Clin. Chem. 47(1): 13-27 y Stibler y col. en "Carbohydrate-deficient consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann y col.), Pergamon, 1988, Vol. 71, páginas 353-357).

Se ha caracterizado bien la estructura de Tf y el mecanismo de la unión al receptor, la unión y liberación de hierro y se ha elucidado la unión al ión carbonato (Patentes de los Estados Unidos 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray y col. (1983) J. Biol. Chem. 258(6): 3543-3546).

Se han usado también transferrina y los anticuerpos que se unen al receptor de la transferrina para administrar o trasportar agentes tóxicos a células tumorales como terapia para el cáncer (Baselga y Mendelsohn, 1994), y se ha usado transferrina como un vector no vírico de terapia génica para administrar ADN a las células (Frank y col, 1994; Wagner y col, 1992). Se ha demostrado la capacidad de liberar proteínas en el sistema nervioso central (SNC) usando el receptor de la transferrina como punto de entrada con diversas proteínas y péptidos entre los que se incluyen CD4 (Walus y col, 1996), el factor neurotrófico derivado de cerebro (Pardridge y col, 1994), factor neurotrófico derivado de la glia (Albeck y col), un análogo de péptido vasointestinal (Bickel y col, 1993), un péptido beta-amiloide (Saito y col, 1995), y un oligonucleótido de sentido contrario (Pardridge y col, 1995).

Sin embargo, las proteínas de fusión de la transferrina no se han modificado o construido mediante ingeniería genética para prolongar la semivida circulatoria in vivo de una proteína ni de un péptido terapéutico o para aumentar la biodisponibilidad reduciendo o inhibiendo la glicosilación del resto de Tf ni para reducir o evitar la unión al receptor de Tf y/o el hierro.

Resumen de la invención

Según se describe con más detalle a continuación, la presente invención incluye una biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado a al menos un segundo polipéptido, en el que el péptido Tf tiene afinidad reducida por un receptor de la transferrina (TfR).

En una realización preferida, las proteínas de fusión Tf modificadas comprenden un resto Tf de transferrina humana que se ha modificado para reducir o evitar la unión al hierro y al receptor y opcionalmente la glicosilación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Muestra una alineación de la Regiones N y C de la transferrina (Tf) Humana (Hu) (aminoácidos 1-331 y 332-679 de la SEC DE ID Nº: 3, respectivamente) con las similitudes e identidades resaltadas.

Figura 2A-2B. Muestra una alineación de las secuencias de transferrina de diferentes especies animales. Sombreo claro: Similitud; Sombreo oscuro: Identidad. Las especies son como sigue: conejo (SEC DE ID Nº: 37), rata (SEC DE ID Nº: 38); ratón (SEC DE ID nº: 39), caballo (SEC DE ID Nº: 40), bovino (SEC DE ID Nº: 41), cerdo (SEC DE ID Nº: 42) y pollo (SEC DE ID Nº: 43.

Figura 3. Muestra la localización de un número de emplazamientos de inserción de Tf expuestos a la superficie en proteínas, polipéptidos o péptidos terapéuticos.

Figuras 4A-4B. Muestran las regiones V_H y V_L de numerosos anticuerpos anti-TNFa usados para producir proteínas de fusión Tf modificadas. Las regiones V_H son como sigue: V_H de ScFv sintético, Nº de Acceso al GenBank AAK83057 (SEC DE ID Nº: 44), V_H de la SEC DE ID Nº: 5 de la Patente de los Estados Unidos Nº 5.698.195 (SEC DE ID Nº: 45), V_H de Nº de Acceso al GenBank BAB 18250 (SEC DE ID Nº: 46), V_H...

1. Biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer polipéptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo péptido, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el receptor transferrina (TfR).

2. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf comprende la región N de una proteína Tf.

3. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf está constituido por la región N de una proteína Tf.

4. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf comprende una porción de la región N de una proteína Tf.

5. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf muestra una glicosilación reducida.

6. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido está fusionado con el extremo C-terminal del péptido Tf.

7. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido está fusionado con el extremo N-terminal del péptido Tf.

8. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido se inserta en el péptido Tf.

9. Biblioteca de la reivindicación 8, en la que el segundo péptido está insertado en un bucle expuesto a la superficie del péptido Tf.

10. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que las proteínas de fusión comprenden adicionalmente un enlazante flexible entre el péptido transferrina y el péptido aleatorio.

11. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que cada uno de los segundos péptidos de la biblioteca es diferente.

12. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR).

13. Biblioteca de la reivindicación 12, en la que el segundo péptido comprende tres CDR de anticuerpo diferentes.

14. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido comprende aproximadamente 6 o más aminoácidos.

15. Biblioteca de la reivindicación 14, en la que el segundo péptido comprende de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 aminoácidos.

16. Biblioteca de la reivindicación 15, en la que el segundo péptido comprende aproximadamente 6, 9, 12, 16, 19, 20, 25, o 30 aminoácidos.

17. Biblioteca de moléculas de ácido nucleico que codifican una biblioteca de la reivindicación 1.

18. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la biblioteca es una biblioteca de presentación de fagos no líticos.

19. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la biblioteca es una biblioteca de péptidos aleatorios o una biblioteca de péptidos naturales.

20. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la biblioteca es una biblioteca de péptidos estructurados, una biblioteca de proteínas, una biblioteca de anticuerpos humanos, una biblioteca de péptidos lineales, o una biblioteca de enzimas.

21. Procedimiento para cribar una proteína de fusión de transferrina que tiene una actividad particular que comprende:

a) proporcionar una biblioteca de fagos que contiene una pluralidad de proteínas de fusión, comprendiendo cada una un primer péptido de transferrina (Tf) fusionado con al menos un segundo péptido en el que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el receptor transferrina (TfR); y

b) cribar la biblioteca para identificar las proteínas de fusión de transferrina que tienen la actividad particular.

22. Procedimiento de la reivindicación 21, que comprende además aislar al menos una proteína de fusión identificada en la etapa (b).

23. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende una proteína pIII de fago.

24. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el segundo péptido comprende al menos una sustitución, delección o adición al resto de aminoácido correspondiente a un aminoácido de la SEC. DE ID. Nº: 3 seleccionada entre el grupo constituido por Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr 426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127, Thr 452, Arg 456, Ala 458, y Gly 459.

25. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf no se une a TfR.

26. Biblioteca de la reivindicación 25, en la que el segundo péptido comprende al menos una sustitución, delección o adición al resto de aminoácido correspondiente a un aminoácido de la SEC. DE ID. Nº 3 seleccionada entre el grupo constituido por Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr 426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127, Thr 452, Arg 456, Ala 458, y Gly 459.

27. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el hierro.

28. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf no se une al hierro.

29. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que la proteína Tf comprende al menos una mutación que evita la glicosilación.

30. Biblioteca de la reivindicación 29, en la que la mutación corresponde a una mutación en el aminoácido N413 o en el aminoácido N611.

31. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf tiene una afinidad reducida por el bicarbonato.

32. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf no se une al bicarbonato.

33. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf está modificado en uno o más de los emplazamientos internos seleccionado entre el grupo que comprende el emplazamiento de unión al hierro, el emplazamiento de la bisagra, el emplazamiento de unión al bicarbonato, y el emplazamiento de unión al receptor.

34. Biblioteca de la reivindicación 1, en la que el péptido Tf comprende una única región N de una proteína Tf.