Una proteína de fusión terapéutica dirigida que comprende un agente terapéutico que comprende los restos aminoacídicos 70-952 de la GAA humana,

estando los restos 1-69 delecionados y un marcador peptídico, en el que el marcador peptídico se une directa o indirectamente al resto aminoacídico 70 de la GAA humana y dicho marcador comprende el resto 1 del IGF-II seguido por los restos 8-67, estando los restos 2-7 delecionados

Alfa glucosidasa ácida y fragmentos de la misma.

Referencia con solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio del documento de Estados Unidos Nº de Serie 60/543.812 presentado el 10 de febrero de 2004.

Antecedentes

La alfa glucosidasa ácida (GAA) es una enzima lisosomal que hidroliza el enlace alfa 1-4 en maltosa y otros oligosacáridos lineales, incluyendo las ramificaciones externas del glucógeno, degradando de esta manera el exceso de glucógeno en el lisosoma (Hirschhorn y col. (2001) en The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, Scriver, y col., eds. (2001), McGraw-Hill: Nueva York, págs. 3389-3420). Al igual que otras enzimas lisosomales de mamíferos, la GAA se sintetiza en el citosol y atraviesa el RE donde se glicosila con carbohidratos de tipo alto contenido en manosa, unidos a N. En el aparato de Golgi, el carbohidrato de alto contenido en manosa se modifica en proteínas lisosomales por la adición de manosa-6-fosfato (M6P) que dirige estas proteínas al lisosoma. Las proteínas modificadas con M6P se suministran al lisosoma mediante la interacción con cada uno de dos receptores de M6P. La forma de modificación más favorable es cuando se añaden dos M6P a un carbohidrato de alto contenido en manosa.

La actividad de GAA insuficiente en el lisosoma da como resultado la enfermedad de Pompe, una enfermedad también conocida como deficiencia de maltasa ácida (AMD), enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo II (GSDII), glucogénesis de tipo II o deficiencia de GAA. La actividad enzimática disminuida se produce debido a una diversidad de mutaciones erróneas y sin sentido en el gen que codifica la GAA. Por consiguiente, el glucógeno se acumula en los lisosomas de todas las células en pacientes con la enfermedad de Pompe. En particular, la acumulación de glucógeno es más pronunciada en los lisosomas del músculo cardiaco y esquelético, hígado y otros tejidos. El glucógeno acumulado en última instancia perjudica la función muscular. En las formas más graves de la enfermedad de Pompe, la muerte se produce después de dos años de edad debido a fallos cardiorrespiratorios.

Actualmente, no se ha aprobado ningún tratamiento disponible para curar o retrasar el progreso de la enfermedad de Pompe. Las terapias de reemplazo enzimático actualmente en ensayos clínicos requieren que las células del los tejidos muscular y hepático capten la GAA administrada recombinante y se transporten a los lisosomas en estas células de una manera dependiente de M6P. Sin embargo, la GAA recombinante producida en células CHO modificadas por ingeniería genética y en la leche de conejos transgénicos, dos fuentes de enzimas usadas en ensayos recientes de terapia de reemplazo enzimático de Pompe, contiene muy poca M6P (Van Hove y col. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93 (1): 65-70; y en la Patente de Estados Unidos Nº 6.537.785). Por lo tanto, el suministro dependiente de M6P de la GAA recombinante a los lisosomas no es eficaz, necesitando dosis elevadas e infusiones frecuentes. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad de procedimientos nuevos, más simples, más eficaces y más rentables para dirigir la enzima GAA terapéutica a los lisosomas de los pacientes.

Sumario de la invención

La presente invención permite el direccionamiento independiente de MP6 de las enzimas GAA o de tipo GAA humanas a los lisosomas del paciente usando una estrategia de direccionamiento basada en marcadores peptídicos. Como resultado, la presente invención proporciona el suministro eficaz de las enzimas GAA o de tipo GAA hacia las células diana.

La invención se refiere, en parte, al descubrimiento de que la GAA puede expresarse de manera recombinante usando una pluralidad de fases de lectura abierta que codifican polipéptidos que representan diferentes partes de la proteína GAA. Cuando se proporcionan juntas, los polipéptidos resultantes pueden cooperar para proporcionar la actividad enzimática deseada.

Por consiguiente, la presente invención se refiere en un aspecto a una proteína de fusión terapéutica dirigida como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1-1 a 1-14 representan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de los miembros seleccionados de 31 familias de glucósido hidrolasas.

La Figura 2 es una representación esquemática de la proteína GAA.

La Figura 3 representa estrategias ejemplares para la creación de una GAA marcada con péptidos.

La Figura 4 representa un experimento de captación ejemplar usando GAA de tipo silvestre y SS-GAA?1-69.

La Figura 5 representa un experimento de captación ejemplar usando SS-GAA?1-69 y SS-GILT?2-7-GAA?1-69.

La Figura 6 representa un análisis de transferencia de Western ejemplar de las proteínas GAA marcadas con 1-87-IGF-II; el panel de la izquierda se probó con un anticuerpo anti-GAA; el panel de la derecha se probó con un anticuerpo anti-IGF-II. Carril 1: pCEP-GILT1-87-GAA56-952; carril 2: pCEP-GILT1-87-R68A-GAA56-952-1; carril 3: pCEP-GILT1-87-R68A-?GS-GAA56-952-1; carril 4: pCEP-GILT?2-7-spcr1-GAA70-952-1; carril 5: pCEP-GAA; carril 6: pCEP-GILT-GAA29-952.

La Figura 7 representa un análisis de transferencia de Western ejemplar comparando la proteolisis de la GAA de tipo silvestre con la GAA-791Asc.

La Figura 8 representa un análisis de transferencia de Western ejemplar de construcciones de la GAA de tipo silvestre y de la GAA con un marcador GILT modificado por ingeniería genética con un sitio proteasa de Factor X corriente abajo, GAA787GILTXa, GAA779GILTXa y GAA796GILTXa. También representa un modelo de procesamiento de GAA C-terminal.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un medio para la producción de GAA que es más eficaz dirigiendo a los lisosomas de las células de mamíferos, por ejemplo, células del músculo cardíaco y esquelético humano. La GAA es un miembro de 31 familias de glucósido hidrolasas (Figuras 1-1 a 1-14). La GAA humana se sintetiza como un precursor de 110 kDal (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268 (3): 2223-31). La forma madura de la enzima es una mezcla de monómeros de 70 y 76 kDal (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31). La enzima precursora tiene siete sitios potenciales de glicosilación y cuatro de éstos se conservan en la enzima madura (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31). Los eventos de escisión proteolítica que producen la enzima madura ocurren en endosomas tardíos o en el lisosoma (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31).

Los 160 aminoácidos C-terminal no se encuentran en la especie madura de 70 y 76 kDal. Sin embargo, determinados alelos de Pompe que dan como resultado la pérdida completa de la actividad de GAA mapean en esta región, por ejemplo Val949Asp (Becker y col. (1998) J. Hum. Genet. 62: 991). El fenotipo de este mutante indica que la parte C-terminal de la proteína, aunque no la parte de la especie de 70 ó 76 kDal, desempeña un papel importante en la función de la proteína. Se ha descrito recientemente que la parte C-terminal de la proteína, aunque se escinde del resto de la proteína durante el procesamiento, permanece asociada con la especie principal (Moreland y col. (1 de nov, 2004) J. Biol. Chem., Manuscript 404008200). Por consiguiente, los restos C-terminal podrían desempeñar una función directa en la actividad catalítica de la proteína. De manera alternativa, los restos C-terminal pueden estar implicados en promover el plegamiento adecuado de las partes N-terminal de la proteína.

Esta última posibilidad se sustenta por el comportamiento de determinados alelos de sacarasa-isomaltasa, una proteína relacionada. Esta familia incluye la proteína sacarasa-isomaltasa (SI) que contiene los dos dominios catalíticos glucósido hidrolasa homólogos, pero distintos, en tándem en un sólo polipéptido. Cada uno de éstos es similar en tamaño al polipéptido GAA completo y los dos dominios comparten una identidad del 36 y del 39% con GAA. La SI se expresa en las células intestinales de borde en cepillo y se localiza en la membrana apical de estas células polarizadas con los dominios catalíticos orientados hacia el lumen intestinal debido a un dominio transmembrana amino-terminal. Una vez que llega a la membrana apical, el dominio sacarasa se escinde del dominio isomaltasa amino-proximal por tripsina, mientras que el dominio isomaltasa permanece asociado a la membrana. Recientes estudios indican que el dominio sacarasa es necesario para el plegamiento adecuado...

1. Una proteína de fusión terapéutica dirigida que comprende un agente terapéutico que comprende los restos aminoacídicos 70-952 de la GAA humana, estando los restos 1-69 delecionados y un marcador peptídico, en el que el marcador peptídico se une directa o indirectamente al resto aminoacídico 70 de la GAA humana y dicho marcador comprende el resto 1 del IGF-II seguido por los restos 8-67, estando los restos 2-7 delecionados.

2. El terapéutico dirigido de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un espaciador entre el agente terapéutico y el marcador peptídico.

3. El terapéutico dirigido de la reivindicación 2 en el que el espaciador es un engarce Gly-Ala-Pro.

4. El terapéutico dirigido de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe.