32144, UNA HIDROLASA HUMANA DE AMIDAS DE ACIDOS GRASOS Y SUS USOS.

Un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón,

colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1;

b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que hibrida específicamente con la sonda;

c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1;

d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que hibrida específicamente con la sonda;

e) comparar el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra,

en la que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica a un sujeto que tienen un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario

32144, una hidrolasa humana de amidas de ácidos grasos y sus usos.

Antecedentes de la invención

Las amidas de ácidos grasos representan una familia creciente de lípidos bioactivos con diversos efectos celulares y fisiológicos (Cravatt, B.F. et al. (1995), Science 268:1506-1509; Devane, W.A. et al. (1992), Science 258:1946-1949; Facci, L. et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3376-3380). Miembros de esta familia incluyen oleamida, un lípido inductor del sueño, y anandamida, un ligando endógeno en el receptor cannabinoide CB1 del cerebro (Cravatt, B.F. et al. (1995), supra; Cravatt, B.F. et al. (1996), J. Am. Chem. Soc. 118:580-590).

Además de sus propiedades inductoras del sueño, la oleamida ha mostrado que potencia la respuesta de los receptores 5-HT₂ a la serotonina (Huidobro-Toro, J. et al. (1996), Proc. Natl. Acad, Sci, 93:8078-8082). La anandamida ha mostrado que tiene efectos analgésicos en ratas (Devane, W.A. et al. (1992), supra) y, a un nivel celular y molecular, se ha demostrado que regula la actividad quinasa de adhesión focal en cortes del hipocampo (Derkinderen, P. et al. (1996), Science 273:1719-1722) y que inhibe la proliferación celular inducida por la prolactina y/o el factor de crecimiento nervioso en las líneas celulares del cáncer de mama humano (DiMarzo et al. (2000), Prostaglandins Other Lipid Mediat, 61(1-2):43-61; DePetrocellis (1998), Proc Natl Acad Sci 95(14):8375-80). Además, la anandamida inhibe el canal de iones de 5-HT₃ en neuronas del ganglio nodoso de rata (Fan, P. (1995), J. Neurophysiol. 73:907-910) y detiene el desarrollo de la preimplantación de embriones de ratón (Paria, B. C. et al. (1995), Proc. Natl. Acad Sci. 92:9460-9464), y se ha encontrado que tanto la oleamida como la anandamida bloquean la comunicación por conexión comunicante en las células gliales (Venance, L. et al. (1995), Nature 376:590-594). Otras amidas de ácido graso se han presentado por poseer actividades biológicas, también (Facci, L. et al. (1995), supra). En particular, se ha mostrado que la etanolamida de palmitoilo enlaza de forma selectiva sobre la anandamida al receptor cannabinoide periférico CB2, indicando quizás que los receptores CB1 y CB2 reconocen distintas amidas de ácido graso como sus respectivos ligandos (Barg, J. et al. (1995), Eur. J. Pharmacol. 287:145-152; Skaper, S.D. et al. (1996), Proc. Natl. Acad Sci. 93:3484-3989).

Los efectos neurofisiológicos tanto de la oleamida como de la anandamida, junto con el aislamiento de estos compuestos desde el fluido cerebroespinal y el tejido cerebral, respectivamente, sugieren que las amidas de ácidos grasos pueden cumplir importantes papeles neuromodulatorios en el sistema nervioso central. Asimismo, los efectos de la anandamida en la proliferación celular y la actividad quinasa de adhesión focal sugieren que las amidas de ácidos grasos pueden ser importantes agentes anti-cancerígenos.

Las amidas de ácidos grasos se hidrolizan por enzimas conocidas como hidrolasa de amida de ácidos grasos (Ueda et al. (2000), Chem Phys Lipids 108(1-2):107-21). Las hidrolasas de amidas de ácidos grasos (FAAHs) se han clonado del plasma de hígado de rata y se ha demostrado que hidrolizan tanto oleamida como anandamida, además de varias amidas de ácidos grasos distintas (Cravatt et al. (1996), Nature 384:83-7). Estudios de hibridación in situ han mostrado la expresión destacada de FAAH en una variedad de células neuronales de rata. También se han presentado hidrolasas de amida de ácidos grasos humanas y de ratón (Giang, D.K. y Cravatt (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2238-2242.

El documento WO 0151628 proporciona nuevos resultados, en los que cambios en los niveles de expresión de uno o más de los resultados están correlacionados con la presencia de cáncer de mama. El documento WO 0183524 proporciona métodos para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con la expresión aberrante de las proteínas del metabolismo de ARN humano (RMEP).

Dado el papel crítico de los FAAHs en el metabolismo de las amidas de ácidos grasos, existe una necesidad de identificar y caracterizar nuevos miembros de esta familia de enzimas.

Compendio de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un nuevo miembro de la familia de la hidrolasa de amida de ácidos grasos, denominada en este documento como "32144". La secuencia de nucleótidos de un cADN que codifica 32144 se muestra en la SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido 32144 se muestra en SEQ ID NO:2. Además, las secuencias de nucleótidos de la región de codificación se representan en la SEQ ID NO: 3.

En un aspecto la invención proporciona un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método: a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida de forma específica una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que hibrida de forma específica la sonda; c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida de forma específica una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que hibrida específicamente la sonda; e) comparar el nivel de ácidos nucleicos que hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de ácidos nucleicos que hibridan con la sonda en la segunda muestra, en la que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

En una realización, dicha sonda de hibridación está marcada de forma detectable. En una realización, dicha detección es por hibridación in situ.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método: a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con un cebador de primera y segunda amplificación, cada uno de los cuales hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: i) una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; y ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; b) incubar la primera muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico; c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con dicho cebador de primera y segunda amplificación; d) incubar la segunda muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico; y e) comparar el nivel de la amplificación de ácido nucleico en la primera muestra respecto al nivel de amplificación de ácido nucleico en la segunda muestra, en la que un nivel aumentado de amplificación de ácido nucleico en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, que comprende:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende polipéptidos con un anticuerpo que enlaza específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y ii) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1...

1. Un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1;

b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que hibrida específicamente con la sonda;

c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1;

d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que hibrida específicamente con la sonda;

e) comparar el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra,

en la que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica a un sujeto que tienen un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha sonda de hibridación está marcada de forma detectable.

3. El método según la reivindicación 1, en el que dicha detección es por hibridación in situ.

4. Un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con un cebador de primera y segunda amplificación, cada uno de los cuales hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: