Métodos para construir bibliotecas de presentación de paquetes genéticos para miembros de una familia diversa de péptido.

Un método para obtener una biblioteca que presenta una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético, comprendiendo el método las etapas de:

(i) escindir un ácido nucleico en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en la región en la que se desea la escisión; en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; y

(b) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en el que la endonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción;

realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura entre 45ºC y 75ºC, en la que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en la que el resto del ácido nucleico monocatenario es monocatenario, y en la que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura; y

(ii) presentar un miembro de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas codificada por el ácido nucleico escindido en la superficie de un paquete genético y presentar colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10179786.

Solicitante: DYAX CORP..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 55 Network Drive Burlington, MA 01803 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LADNER, ROBERT, C., ROOKEY,Kristin L, HOET,René, COHEN,EDWARD HIRSCH, NASTRI,HORACIO GABRIEL.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/18 (contra materiales animales o humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/66 (Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > TECNOLOGIA COMBINATORIA > QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS,... > Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas > C40B40/02 (Bibliotecas contenidas en o exhibidas por microorganismos, p. ej. bacterias o células animales; Bibliotecas contenidas en o exhibidas por vectores, p. ej. plásmidos; Bibliotecas que únicamente contienen microorganismos o vectores)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > TECNOLOGIA COMBINATORIA > QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS,... > Procedimientos de creación de bibliotecas, p. ej.... > C40B50/06 (Procedimientos bioquímicos, p. ej. empleando enzimas o microorganismos enteros viables)

PDF original: ES-2531551_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Métodos para construir bibliotecas de presentación de paquetes genéticos para miembros de una familia diversa de péptidos

La presente invención se refiere a métodos, como se definen en las reivindicaciones, para construir bibliotecas de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas, y presentan colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia. En una realización preferida, los polipéptidos presentados son Fab humanos.

Más específicamente, los métodos de la invención comprenden escindir ácidos nucleicos monocatenarios en localizaciones seleccionadas, codificando los ácidos nucleicos escindidos, al menos en parte, los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados en los paquetes genéticos de las bibliotecas de la invención. En una realización preferida, los paquetes genéticos son fagos o fagómidos filamentosos.

La presente memoria descriptiva describe métodos para identificar las bibliotecas de paquetes genéticos que presentan péptidos, polipéptidos y proteínas útiles, y a los péptidos, polipéptidos y proteínas identificados por dicha identificación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Es ahora práctica habitual en la técnica preparar bibliotecas de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presentan colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia. En muchas bibliotecas comunes, los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados están relacionados con anticuerpos. Con frecuencia, son Fabs o anticuerpos monocatenarios.

En general, los ADN que codifican miembros de las familias a presentar deben amplificarse antes de que se clonen y se usen para presentar el miembro deseado en la superficie de un paquete genético. Dicha amplificación típicamente hace uso de cebadores directos e inversos.

Tales cebadores pueden ser complementarios de secuencias nativas del ADN a amplificar, o complementarios de oligonucleótidos unidos en los extremos 5 o 3 de ese ADN. Los cebadores que son complementarios de secuencias nativas del ADN a amplificar tienen la desventaja de que dan preferencia a los miembros de las familias a presentar. Se amplificarán solamente los miembros que contengan una secuencia en el ADN nativo que sea sustancialmente complementaria del cebador. Los que no, estarán ausentes de la familia. Para los miembros que se amplifican, se suprimirá cualquier diversidad dentro de la región del cebador.

Por ejemplo, en la patente europea 368.684 B1, el cebador que se usa está en el extremo 5 de la región Vh de un gen de anticuerpo. Se híbrida con una región de secuencia en el ADN nativo que se afirma que está suficientemente bien conservada dentro de una única especie. Tal cebador tendrá preferencia por los miembros amplificados frente a los que tengan esta región conservada. Se extingue cualquier diversidad dentro de esta región.

Se acepta generalmente que los genes de anticuerpos humanos surgen a través de un proceso que implica una selección combinatoria de V y J, o V, D y J, seguido de mutaciones somáticas. Aunque la mayor diversidad se produce en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), también se produce diversidad en las regiones del marco (FR) más conservadas y al menos parte de esta diversidad confiere o potencia la unión específica a antígenos (Ag). Como consecuencia, las bibliotecas deberían contener tanta diversidad de CDR y FR como sea posible.

Para clonar los ADN amplificados para presentación en un paquete genético de los péptidos, polipéptidos o proteínas que codifican, los ADN deben escindirse para producir extremos apropiados para ligación a un vector. Dicha escisión se efectúa generalmente usando sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción portados en los cebadores. Cuando los cebadores están en el extremo 5 de ADN producido a partir de transcripción inversa de ARN, dicha restricción deja regiones no traducidas 5 perjudiciales en el ADN amplificado. Estas regiones interfieren con la expresión de los genes clonados, y de este modo con la presentación de los péptidos, polipéptidos y proteínas codificados por ellas.

Zhu D., Analytical Biochemistry, Vol. 177(1), 1989, páginas 120-124, describe la escisión dirigida por oligodesoxinucleótidos y la reparación de un vector monocatenario: un método de mutagénesis específica del sitio.

Thielking V et al., Biochemistry, Vol. 29(19), 1990, páginas 4682-4691, describen la exactitud de la endonucleasa de restricción ECO-RI en estudios de unión y escisión con sustratos oligodesoxinucleotídicos que contienen secuencias de reconocimiento degeneradas.

Alves Juergen et al., Biochemistry, Vol. 34(35), 1995, páginas 11191-11197, describen la exactitud de la endonucleasa de restricción EcoRV en estudios de unión y escisión con sustratos oligodesoxinucleotídicos que contienen secuencias de reconocimiento degeneradas.

Kim S.C. et al., Science, Vol. 240, No. 4851, 1988, páginas 504-506, describen la escisión de ADN en cualquier sitio predeterminado con cebadores adaptadores y enzimas de restricción clase US.

Podhajska A.J. y Szybalski W., Gene, Vol. 40(2-3), 1985, páginas 175-182, describen la conversión de la endonucleasa FOK-I en una enzima de restricción universal que escinde ADN fágico M-13-MP-7 en sitios predeterminados.

El documento WO 97/20923 describe la preparación de una biblioteca multicombinatoria de vectores de expresión de genes de anticuerpos.

El documento WO 97/49809 describe polipéptidos capaces de formar estructuras de unión a antígeno con especificidad por los antígenos Rhesus D, el ADN que los codifica, y el procedimiento para su preparación y uso.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos métodos para construir bibliotecas de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presentan de forma colectiva al menos una porción de la diversidad de esta familia. Estos métodos no tienen preferencia por ADN que contienen secuencias nativas que son complementarias de los cebadores usados para amplificación. También permiten que cualquier secuencia que pueda ser perjudicial para la expresión se elimine del ADN amplificado antes de la clonación y presentación.

La memoria descriptiva describe un método para escindir secuencias de ácidos nucleicos monocatenarias en una localización deseada, comprendiendo el método las etapas de:

(i) poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea escisión e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción que, en la restricción, da como resultado la escisión del ácido nucleico en la localización deseada; y

(ii) escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;

realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que es activa a la temperatura escogida.

La memoria descriptiva describe un método alternativo para escindir... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para obtener una biblioteca que presenta una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético, comprendiendo el método las etapas de:

(i) escindir un ácido nucleico en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en la región en la que se desea la escisión; en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región ¡ocalmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; y

(b) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en el que la endonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción;

realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura entre 45°C y 75°C, en la que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en la que el resto del ácido nucleico monocatenario es monocatenario, y en la que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura; y

(ii) presentar un miembro de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas codificada por el ácido nucleico escindido en la superficie de un paquete genético y presentar colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia.

2. Un método para obtener una biblioteca que presenta una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético, comprendiendo el método las etapas de:

(i) escindir un ácido nucleico en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido complementaria del ácido nucleico monocatenario en la región en la que se desea la escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo ll-S; en el que el ácido nucleico monocatenario y laregión monocatenaria del oligonucleótido se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de escisión de Tipo ll-S; y

(b) escindir el ácido nucleico en el sitio de escisión de Tipo ll-S, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción de Tipo ll-S con la región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la endonucleasa de restricción de Tipo ll-S es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo ll-S;

realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura entre 45°C y 75°C, en la que el ácido nucleico monocatenario y la región monocatenario del oligonucleótido se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en la que el resto del ácido nucleico monocatenario es monocatenario, y en la que la endonucleasa de Tipo ll-S está activa a la temperatura; y

(ii) presentar un miembro de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas codificada por el ácido nucleico escindido en la superficie del paquete genético y presentar colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que los ácidos nucleicos codifican al menos una porción de una inmunoglobulina.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la inmunoglobulina comprende un Fab o Fv monocatenario.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una porción de una cadena pesada, o al menos una porción de la cadena ligera.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 a 5, en el que las secuencias de ácido nucleico derivan al menos en parte de pacientes que padecen al menos una enfermedad autoinmune y/o cáncer.

7. Los métodos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprenden además una etapa de amplificación de ácido nucleico antes de la etapa (i), o entre las etapas (i) y (ii).

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la endonucleasa de restricción se selecciona del grupo que comprende MaeIII, 7~sp45l, Hph\, SsaJI, Alu\, Blp\, DdeI, Bglll, Msll, Bs/EI, Eael, Eagl, Haelll, Bsf4CI, HpyCH4lll, Hinfl, Mly\, PieI, Mnl\, HpyCH4V, BsmA\, Bpm\, Xmn\, y Sacl.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que al menos una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es humana.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una porción de la FR1.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que al menos una porción de la FR1 es humana.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la enfermedad autolnmune se selecciona del grupo que comprende lupus eritematoso, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, síndrome antifosfolipídico y vasculltls.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que los ácidos nucleicos se aislan al menos en parte del grupo que comprende células de sangre periférica, células de médula ósea, células del bazo y células de ganglios linfáticos.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende ligar un adaptador de ADN sintético parcialmente bicatenarlo al ácido nucleico monocatenarlo escindido, y clonar el ácido nucleico a un vector.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el adaptador de ADN sintético parcialmente bicatenarlo comprende una reglón blcatenarla de 12-100 nucleótidos.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el adaptador de ADN sintético parcialmente bicatenarlo comprende un sitio de endonucleasa de restricción.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el adaptador de ADN sintético parcialmente bicatenario comprende una reglón blcatenaria de 2-15 bases.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además preparar una colección de ácidos nucleicos que codifican al menos en parte miembros de la familia diversa.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además hacer monocatenario al ácido nucleico.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la endonucleasa de restricción de Tipo ll-S se selecciona del grupo que comprende AarICAC, Acelll, Bbr7\, Bbv\, BbvII, Bce83\, BceAl, Bcefl, BcNI, Bf/'l, Bin\, BscA\, BseRI, BsmFI, BspMI, Eci\, Eco57\, Rau\, Fok\, Gsu\, Hga\, Hph\, MboW, Mly\, MmeI, Mnl\, PieI, RíeAl, SfaNI, SspD5l, Stl71321, Sfsl, Tagll, Tth111 II, o UbaP\.