Mejora de ensayos de fijación mediante análisis multiepitópico.

Método para detectar un analito en una muestra, el cual comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida que comprende un soporte no poroso y, como mínimo, dos áreas de ensayo separadas espacialmente, cada una de la cuales contiene distintos receptores inmovilizados, específicos del analito, (b) puesta en contacto de la muestra con la fase sólida y al menos un receptor libre, específico del analito, que lleva un grupo generador de señal o capaz de unirse con un grupo generador de señal, y (c) detección de la presencia o/y de la cantidad de analito mediante la determinación del grupo generador de señal sobre las áreas de ensayo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP1999/004310.

Solicitante: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: SANDHOFER STRASSE 112-132 68305 MANNHEIM ALEMANIA.

Inventor/es: KARL, JOHANN, HORNAUER, HANS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/543 (con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/58 (en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/569 (para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/576 (para la hepatitis)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/545 (Resina sintética)

PDF original: ES-2268874_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Mejora de ensayos de fijación mediante análisis multiepitópico

La presente invención se refiere a un método para detectar uno o varios analitos en una muestra, identificando el analito con diversos reactivos capaces de fijarse a los analitos. Además la presente invención comprende una fase sólida para detectar un analito, formada por un soporte no poroso y por áreas de ensayo separadas espacialmente, de tal modo que cada área de ensayo contiene reactivos diferentes.

Los métodos de detección inmunológica permiten determinar un gran número de analitos. Dichos métodos de detección inmunológica se basan en la capacidad de fijación específica de analitos mediante determinados analitos, como por ejemplo en las interacciones de tipo antígeno-anticuerpo. Básicamente las determinaciones inmunológicas se pueden realizar en una serie de formatos de ensayo, como por ejemplo los de ensayo tipo sándwich, indirecto, valoración por retroceso o puente.

La identificación fiable de las enfermedades infecciosas, p.ej. de una infección por virus, como por ejemplo VIH, VHB o VHC, es de especial interés, para poder diagnosticar cuanto antes las personas afectadas. Generalmente, las determinaciones inmunológicas de anticuerpos contra VIH, VHB o VHC se efectúan mediante el formato de ensayo indirecto o mediante el formato puente. En estos casos, para detectar los anticuerpos se emplean casi siempre mezclas de varias proteínas o péptidos que llevan epítopos procedentes de la región nuclear y la envoltura del virus. Esta mezcla se inmoviliza sobre un soporte, es decir, una fase sólida. Dado que la clasificación como VIH-positivo es de gran importancia para los individuos y que los resultados falsamente positivos pueden tener consecuencias fatales, actualmente es preciso revisar en un ensayo de confirmación todos los resultados positivos obtenidos con esta determinación inmunológica en ensayos rutinarios. Como ensayo de confirmación se suele usar un método Western blot, en el que los componentes proteicos de un Usado vírico están aplicados sobre un soporte poroso. No obstante, en el caso del VHC es muy difícil cultivar el virus. Por tanto, en tal caso, como ensayo de confirmación, no se lleva a cabo ningún Western blot con Usado vírico, sino un RIBA (ensayo inmunoblot recombinante) del tipo dotblot, que comprende proteínas o péptidos recombinantes como reactivos de ensayo.

Un gran inconveniente de los ensayos rutinarios realizados actualmente es que, según el analito, se usan mezclas de 5 hasta 10 o más antígenos para la detección. Aunque los ensayos rutinarios se mejoran continuamente, todavía no se ha podido renunciar del todo a los ensayos de confirmación. Por ejemplo, en el ensayo Enzymun® HIV (de Boehringer Mannheim) se usa una mezcla de unos 5 antígenos diferentes, que para la detección están biotinilados o marcados con digoxigenina. Aunque el ensayo funciona bien, implica el uso de mezclas con un número tan grande de antígenos diferentes, que la inmovilización o fijación de cada uno de ellos sobre la fase sólida impide alcanzar una concentración óptima para la detección. Con una mezcla de tantos componentes la fase sólida no tiene bastante capacidad para fijar todos los antígenos en una concentración óptima. Además, el uso de una mezcla de antígenos para recubrir una superficie de ensayo tiene como consecuencia que los diferentes antígenos compiten por los sitios de fijación sobre la fase sólida y los distintos tamaños pueden producir distintas velocidades de difusión y diversos efectos estéricos. En caso de una aplicación directa, se fijan p.ej. antígenos hidrófobos de manera preferente a la superficie de plástico, mientras que simultáneamente se expulsan antígenos más hidrófilos. En consecuencia, por un lado solo se obtienen resultados difícilmente reproducibles, y por otro, la concentración de ciertos epítopos de antígenos resulta tan pequeña que no permite ninguna detección significativa.

Otra desventaja del uso de mezclas de antígenos en los ensayos rutinarios es que, con la mezcla de diferentes antígenos, aumenta claramente el riesgo de una mayor fijación inespecífica, lo cual incrementa a su vez los resultados falsamente positivos. Como consecuencia, el límite de exclusión en los ensayos rutinarios efectuados hasta ahora debe establecerse bastante alto y por tanto se pierde sensibilidad. Sobre todo en el método Western blot, el número de resultados falsamente positivos por fijación inespecífica aumenta debido a las proteínas extrañas presentes en el lisado vírico, de tal manera que para un resultado positivo se requieren al menos 2 bandas reactivas.

Se ha intentado mejorar aún más la sensibilidad de este método de detección. La patente EP 0 461 462 A1 describe un inmunoensayo para detectar anticuerpos víricos, con la ayuda de un ensayo de tipo indirecto. En el ensayo inmunológico del tipo dotblot descrito en la patente EP 0 461 462 A1, en lugar de un lisado vírico usual se aplican, individualmente, proteínas recombinantes purificadas en áreas de ensayo discretas sobre un substrato poroso, obteniéndose un formato de ensayo que, gracias al uso de proteínas purificadas, es más sensible que un Western blot.

La patente EP 0 627 625 A1 se refiere a un método para detectar anticuerpos víricos en una muestra mediante el formato puente. En este caso también se trata de un RIBA (ensayo inmunoblot recombinante), en que se aplican varios antígenos de manera espacialmente separada sobre una fase sólida de un material poroso, haciendo hincapié en la necesidad de emplear una fase sólida de material poroso.

La patente EP 0 445 423 A2 se refiere a un método para detectar anticuerpos de VHC con la ayuda de varios epítopos de un antígeno VHC. En la patente EP 0 445 423 A2 también se describe un inmunoensayo para la

determinación de anticuerpos, en el cual se alcanza una mayor sensibilidad mediante el uso de ciertos antígenos mejorados.

Ekins R. y otros (Ann. Biol. Clin., 1992, vol. 50, p. 337-353) describen un inmunoensayo microspot multianalito, en el que hay una preparación teórica para incrementar la sensibilidad del ensayo microspot destinado al análisis de varios analitos.

Ekins R. y otros (Analytica Chimica Acta, 1989, vol. 227, p. 73-96) describen planteamientos teóricos para inmuno- ensayos microspot multianalito, con los cuales, en principio, debería ser posible la detección de 10® sustancias diferentes en un volumen de muestra de 100 pl.

Kakabakos y otros (Clin. Chem., 1992, vol. 38/3, p. 338-342) se refieren a un inmunoensayo multianalito, en el cual se pueden detectar cuantitativamente los cuatro analitos LH, FSH, TSH y PRL simultáneamente.

La patente WO 97/32212 revela un sistema óptico para la detección de varios analitos con el uso de un "guíaondas".

La patente WO 93/08472 revela el esbozo de un "ensayo inmunológico ambiental de analitos", es decir, un ensayo independiente del volumen de muestra empleado.

Sin embargo, mediante este método descrito en el estado técnico, resulta difícil depositar una cantidad prefijada de reactivo sobre un soporte poroso de modo definido. Sobre todo cabe el riesgo de que los puntos individuales de ensayo depositados se entremezclen. Estos inconvenientes son más graves cuanto menores son los puntos aplicados, y por lo tanto este método no sirve para los sistemas de ensayo miniaturizados. Además, el manejo de tiras de papel es difícil de automatizar y por tanto es impensable como ensayo rutinario.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consistía en proporcionar un método que permitiera eliminar, al menos en parte, las desventajas del estado técnico.

Según la presente invención, dicho objetivo se resuelve mediante un método para detectar... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para detectar un analito en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida que comprende un soporte no poroso y, como mínimo, dos áreas de ensayo separadas espacialmente, cada una de la cuales contiene distintos receptores inmovilizados, específicos del analito,

(b) puesta en contacto de la muestra con la fase sólida y al menos un receptor libre, específico del analito, que lleva un grupo generador de señal o capaz de unirse con un grupo generador de señal, y

(c) detección de la presencia o/y de la cantidad de analito mediante la determinación del grupo generador de señal sobre las áreas de ensayo, donde el analito es una población heterogénea de anticuerpos o una mezcla heterogénea de antígenos y éstos o los anticuerpos proceden de un agente patógeno o están inducidos por él.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque las áreas de ensayo tienen un diámetro de 0,01 hasta 1 mm.

3. Método según alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la fase sólida se prepara aplicando por separado, de modo directo y específico, los distintos receptores específicos del analito sobre las áreas de ensayo espacialmente separadas.

4. Método según alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el recubrimiento sobre las respectivas áreas de ensayo está formado por un solo tipo de molécula con capacidad de fijación.

5. Método según alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la fase sólida empleada comprende además una área de control que no lleva ningún receptor específico.

6. Método según alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, para la detección de los complejos formados por el analito y los reactivos capaces de fijarlo se emplea un reactivo detector universal, en concreto partículas de látex marcadas.

7. Fase sólida para detección de un analito en una muestra, caracterizada porque consta de un soporte no poroso y de al menos dos áreas de ensayo separadas espacialmente, cada una de las cuales contiene diferentes reactivos para la fijación específica del analito investigado, donde el analito es una población heterogénea de anticuerpos o una mezcla heterogénea de antígenos y éstos o los anticuerpos proceden de un agente patógeno o están inducidos por él.

8. Empleo de una fase sólida según la reivindicación 7 en un ensayo inmunológico.

9. Kit de ensayo para detectar un analito en una muestra, que incluye una fase sólida según la reivindicación 7 y reactivos de detección marcados.

10. Método para la detección de un analito en una muestra, que consta de las siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida que consta de un soporte y de, al menos, dos áreas de ensayo separadas espacialmente, las cuales llevan respectivamente unos receptores inmovilizados, distintos y específicos del analito,

(b) puesta en contacto de la muestra con la fase sólida y al menos un receptor libre, específico del analito, que lleva un grupo generador de señal o que puede unirse a un grupo generador de señal, y

(c) detección de la presencia o/y cantidad del analito por determinación del grupo generador de señal en las áreas de ensayo, de tal manera que, si la señal es superior a un valor límite prefijado y específico del área de ensayo, se clasifica como positiva y, si es inferior a un valor límite prefijado y específico del área de ensayo, se clasifica como negativo.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque los valores umbral se determinan individualmente para cada área de ensayo.