Alteración dirigida de ADN con oligonucleótidos.

Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena que comprende una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN

, comprendiendo el procedimiento

combinar la secuencia de ADN aceptor de doble cadena con al menos un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido,

en el que el primer oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la primera secuencia de ADN y en el que el primer oligonucleótido comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la primera secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho primer oligonucleótido;

y en el que el segundo oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la segunda secuencia de ADN y en el que el segundo oligonucleótido comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la segunda secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido;

y en el que dicho al menos un desapareamiento en el primer oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la primera secuencia de ADN de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena y en el que dicho al menos un desapareamiento en el segundo oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la segunda secuencia de ADN del ADN aceptor de doble cadena, y en el que dichos nucleótidos ocupan posiciones complementarias en el ADN aceptor de doble cadena, en el que el procedimiento no es para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia o para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2011/050805.

Solicitante: KEYGENE N.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: P.O. BOX 216 6700 AE WAGENINGEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: DE BOTH,Michiel,Theodoor,Jan, FURUKAWA,TOMOYUKI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))

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Fragmento de la descripción:

Alteración dirigida de ADN con oligonucleótidos Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento para la alteración dirigida de ADN aceptor, por ejemplo ADN aceptor de doble cadena. El procedimiento comprende el uso de al menos dos oligonucleótidos, teniendo cada oligonucleótido al menos un desapareamiento con respecto al ADN aceptor (doble cadena) dirigido. El desapareamiento del primer oligonucleótido se dirige a un nucleótido en la primera cadena de la doble cadena y el desapareamiento del segundo oligonucleótido se dirige al nucleótido en la segunda cadena que forma una pareja de bases con el nucleótido en la primera cadena. Estos errores de emparejamiento se encuentran en posiciones específicas en dichos oligonucleótidos. También se proporciona un kit que comprende instrucciones para realizar el procedimiento según las invenciones, y oligonucleótidos adecuados para su uso en el procedimiento.

Antecedentes de ¡a invención

[0002] La modificación genética es el proceso de crear deliberadamente cambios en el material genético de células vivas. A menudo, el objetivo es modificar una propiedad biológica codificada genéticamente de esa célula, o del organismo del cual la célula forma parte o en el que se puede regenerar. Estos cambios pueden tomar la forma de eliminación de partes del material genético, la adición de material genético exógeno, o cambios en la secuencia de nucleótidos existente del material genético, por ejemplo mediante la sustitución de un nucleótido por otro.

[0003] Los procedimientos para la modificación genética de organismos eucariotas se conocen desde hace más de 20 años, y han encontrado una amplia aplicación en células vegetales, humanas y animales y microorganismos para mejoras en los campos de la agricultura, la salud humana, la calidad alimentaria y la protección del medio ambiente.

[0004] Una metodología de modificación genética común consiste en añadir fragmentos de ADN exógeno al genoma de una célula, que puede entonces conferir una nueva propiedad a la célula u organismo sobre y por encima de las propiedades codificadas por genes ya existentes (incluyendo aplicaciones en las que la expresión de genes existentes será así suprimida).

[0005] Aunque estos procedimientos pueden tener cierta eficacia en proporcionar las propiedades deseadas a una diana, sin embargo, estos procedimientos no son muy precisos. No existe, por ejemplo, ningún control sobre las posiciones genómica en la que se insertan los fragmentos de ADN exógeno (y por tanto sobre los niveles últimos de expresión). Además, el efecto deseado tendrá que manifestarse por sí mismo sobre las propiedades naturales codificadas por el genoma original y bien equilibrado. Por el contrario, los procedimientos de modificación genética que darán lugar a la adición, deleción o conversión de nucleótidos en loci genómico predefinido permitirán la modificación precisa y controlable de genes existentes.

[0006] El intercambio seleccionado de nucleótidos dirigido por oligonucleótidos (TNE) es un procedimiento que se basa en la liberación en la célula eucariota de oligonucleótidos (sintéticos) (moléculas que constan de tramos cortos de nucleótidos y/o grupos de tipo nucleótido que se asemejan a ADN en sus propiedades de apareamiento de bases Watson-Crick, pero que pueden ser químicamente diferentes del ADN; (Alexeev y Yoon, 1998); (Rice et al, 2001);

(Kmiec, 2003)).

[0007] Mediante el diseño deliberado de un nucleótido con un desapareamiento en la secuencia de homología del oligonucleótido, el nucleótido con un desapareamiento puede inducir cambios en la secuencia de ADN genómica a la que se puede hibridar el nucleótido. Este procedimiento permite la conversión de uno o más nucleótidos en la diana, y puede aplicarse, por ejemplo, para crear codones de parada en genes existentes, dando lugar a una perturbación de su función, o para crear cambios de codón, dando lugar a genes que codifican proteínas con composición de aminoácidos alterada (ingeniería de proteínas).

[0008] El intercambio seleccionado de nucleótidos (TNE) se ha descrito en muchos organismos, incluyendo plantas, animales y células de levadura y también se conoce como mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (ODM).

[0009] Los primeros ejemplos de TNE que utilizaron oligonucleótidos quiméricos ADN:ARN provenían de células animales (revisado en (Igoucheva et al, 2001)). El TNE utilizando oligonucleótidos quiméricos ADN:ARN también se ha demostrado en células de plantas (Beetham et al, 1999; Kochevenko y Willmitzer, 2003; Okuzaki y Toriyama, 2004; Zhu et al, 2000; Zhu et al., 1999). En general, las frecuencias descritas en ambos estudios de plantas y animales eran demasiado bajas para la aplicación práctica de TNE en loci cromosómicos no seleccionares. El TNE utilizando oligonucleótidos quiméricos también se encontró que era difícil de reproducir (Ruiter et al., 2003), dando lugar a una búsqueda de diseños de oligonucleótidos alternativos que proporcionen resultados más fiables.

[0010] Varios laboratorios se han centrado en el uso de oligonucleótidos de cadena única (ss) para TNE. Se ha encontrado que éstos proporcionan resultados más reproducibles tanto en células vegetales como animales (Liu et al.,

2002) (Parekh-Olmedo et al., 2005) (Dong et al., 2006). Sin embargo, el mayor problema al que se enfrenta la aplicación de TNE en células de, en particular, los organismos superiores, tales como plantas, sigue siendo la baja eficacia relativa que se ha descrito hasta el momento. En el maíz se ha descrito una frecuencia de conversión de 1x10'" (Zhu et al., 2000). Estudios posteriores en el tabaco (Kochevenko y Wlllmltzer, 2003) y el arroz (Okuzakl y Torlyama, 2004) han descrito frecuencias de 1 x 10"^ y 1 x 10*", respectivamente.

[0011] El TNE utilizando diversos tipos de ollgonucleótldos ha sido objeto de varias solicitudes de patentes y patentes, Incluyendo US6936467, US7226785, US579597, US6136601, US2003/0163849, US2003/0236208, W003/013226, US5594121 y WO01/92512.

[0012] En US6936467 se contempla que la baja eficacia de la alteración del gen obtenida usando ollgonucleótldos de ADN no modificado es el resultado de la degradación de los ollgonucleótldos de los donantes por las nucleasas presentes en la mezcla de reacción o la célula diana. Se propone Incorporar nucleótldos modificados que hacen que los ollgonucleótldos resultantes sean (más) resistentes frente a las nucleasas. Estas modificaciones se describen que están situadas preferiblemente en los extremos del ollgonucleótldo, mientras que el desapareamlento está presente al menos a 8 nucleótldos de cada extremo terminal.

[0013] El documento US7226785 describe también procedimientos para alteraciones genómlcas cromosómicas dirigidas utilizando ollgonucleótldos monocatenarlos modificados con al menos una reglón terminal resistente a nucleasa modificada. El TNE utilizando ollgonucleótldos de cadena única modificados es también el objetivo de WO02/26967.

[0014] Andrleu-Soler et al. (2005, Nuclelc Aclds Research, Vol. 33, No. 12: 3733-3742) describen la transmisión estable de la modificación dirigida de genes que utilizan ollgonucleótldos de cadena única con LNA flanqueantes. Olsen et al. (2005, J. Gene Med., 7: 1534-1544) describen que la síntesis de ADN está implicada en alteraciones genéticas específicas de sitio Inducidas por ollgonucleótldos de cadena única en células de mamífero seleccionadas.

[0015] Debido a la baja eficacia de los procedimientos actuales de TNE, sigue habiendo una necesidad de técnicas de TNE alternativas y/o mejores. Éstas pueden usarse solas o en combinación con técnicas de TNE existentes, tales como las descritas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena que comprende una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN, comprendiendo el procedimiento

combinar la secuencia de ADN aceptor de doble cadena con al menos un primer oligonucleótido y un segundo

oligonucleótido,

en el que el primer oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la primera secuencia de ADN y en el que el primer oligonucleótido comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la primera secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho primer oligonucleótido;

y en el que el segundo oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la segunda secuencia de ADN y en el que el segundo oligonucleótido comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la segunda secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido;

y en el que dicho al menos un desapareamiento en el primer oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la primera secuencia de ADN de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena y en el que dicho al menos un desapareamiento en el segundo oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la segunda secuencia de ADN del ADN aceptor de doble cadena, y en el que dichos nucleótidos ocupan posiciones complementarias en el ADN aceptor de doble cadena, en el que el procedimiento no es para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia o para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el desapareamiento en el primer oligonucleótido o el desapareamiento en el segundo oligonucleótido se encuentra, independientemente, como máximo 1 nucleótido del extremo 3' de dicho oligonucleótido, más preferiblemente dicho al menos un desapareamiento está en el extremo 3' del oligonucleótido, preferiblemente el desapareamiento en ambos oligonucleótidos está en el extremo 3' de los oligonucleótidos.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio en el primer oligonucleótido y/o en el segundo oligonucleótido comprende o está directamente adyacente a dicho al menos un desapareamiento.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer oligonucleótido es complementario a la primera secuencia de ADN a excepción del desapareamiento y/o en el que el segundo oligonucleótido es complementario a la segunda secuencia de ADN a excepción del desapareamiento.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que el desapareamiento en el primer oligonucleótido está en el extremo 3' y en el que el desapareamiento en el segundo oligonucleótido está en el extremo 3'.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer oligonucleótido y/o el segundo oligonucleótido comprende al menos una sección que contiene al menos un nucleótido modificado, en el que la modificación se selecciona del grupo que consiste en una modificación de bases, una modificación de bases en el extremo 3' y/o 5', una modificación del esqueleto o una modificación de azúcares.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en LNA o enlaces fosforotioato.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que el oligonucleótido comprende al menos dos, tres, cuatro o cinco nucleótidos modificados, preferiblemente el oligonucleótido comprende dos, tres, cuatro o cinco nucleótidos modificados.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el desapareamiento no es un nucleótido modificado.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que el nucleótido modificado es al menos un nucleótido de dicho al menos un desapareamiento situado como máximo 2 nucleótidos, preferiblemente como máximo 1 nucleótido del extremo 3' de dicho oligonucleótido, lo más preferiblemente dicho al menos un desapareamiento está en el extremo 3' del oligonucleótido.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la alteración del ADN aceptor de doble cadena está en una célula, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en un célula procariota, una célula bacteriana, una célula eucariota, una célula vegetal, una célula animal, una célula de levadura, una célula fúngica, una célula de roedor, una célula humana, una célula no humana, y/o una célula embrionaria.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN aceptor de doble cadena se obtiene de un organismo procariota, una bacteria, un organismo eucariota, una planta, un animal, una levadura, un hongo, un roedor o un humano.

13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la alteración es una deleción, una sustitución y/o una inserción de al menos un nucleótido.

14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN aceptor de doble cadena es de ADN genómico, ADN lineal, cromosomas artificiales, cromosomas artificiales de mamífero, cromosomas artificiales de bacterias, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales de planta, ADN cromosómico nuclear, ADN de orgánulos, y/o ADN episomal, incluyendo plásmidos.

15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para alterar una célula, para corregir una mutación mediante la restauración al tipo salvaje, para inducir una mutación, para inactivar una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar la bioactividad de una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar una proteína mediante la alteración de la región codificante.

16. Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena que comprende una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN, comprendiendo el procedimiento

combinar la secuencia de ADN aceptor de doble cadena con al menos un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido,

en el que el primer oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la primera secuencia de ADN y en el que el primer oligonucleótido comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la primera secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho primer oligonucleótido;

y en el que el segundo oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la segunda secuencia de ADN y en el que el segundo oligonucleótido comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la segunda secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido;

y en el que dicho al menos un desapareamiento en el primer oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la primera secuencia de ADN de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena y en el que dicho al menos un desapareamiento en el segundo oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la segunda secuencia de ADN del ADN aceptor de doble cadena, y en el que dichos nucleótidos ocupan posiciones complementarias en el ADN aceptor de doble cadena, en el que el procedimiento no es para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia, en el que el procedimiento se realiza ex vivo; y/o

la alteración de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena está en una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula procariota, una célula bacteriana, una célula vegetal, una célula de levadura y una célula fúngica.

17. Utilización de al menos dos oligonucleótidos, tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para la

alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena, preferiblemente, para alterar una célula, corregir una mutación mediante la restauración al tipo salvaje, para inducir una mutación, para inactivar una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar la bioactividad de una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar una proteína mediante la alteración de la región codificante, reparación de

desapareamientos, alteración dirigida de material genético (planta), incluyendo mutación de genes, reparación dirigida de genes y knockout de genes, en la que la utilización no es para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia.

18. Utilización de al menos dos oligonucleótidos, tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para la

alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena, preferiblemente, para alterar una célula, corregir una mutación mediante la restauración al tipo salvaje, para inducir una mutación, para inactivar una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar la bioactividad de una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar una proteína mediante la alteración de la región codificante, reparación de

desapareamientos, alteración dirigida de material genético (planta), incluyendo mutación de genes, reparación dirigida de genes y knockout de genes, en la que

la utilización se realiza ex vivo; y/o

la alteración de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena está en una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula procariota, una célula bacteriana, una célula vegetal, una célula de levadura y una célula fúngica.

19. Kit que comprende instrucciones para realizar un procedimiento para la alteración dirigida de un ADN aceptor de doble cadena, según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende además al menos dos oligonucleótidos para utilizar en el procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende dichos al menos dos oligonucleótidos tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

20. Kit, según la reivindicación 19, en el que cuando se combina con una secuencia de ADN aceptor de doble cadena que contiene una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN, el primer oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la primera

secuencia de ADN y en el que el primer oligonucleótido comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la primera secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho primer oligonucleótido; y en el que el segundo oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse con la segunda secuencia de ADN y en el que el segundo oligonucleótido 5 comprende además al menos un desapareamiento con respecto a la segunda secuencia de ADN y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos del extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido; y en el que dicho al menos un desapareamiento en el primer oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la primera secuencia de ADN de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena y en el que dicho al menos un desapareamiento en el segundo oligonucleótido es relativo a un nucleótido en la segunda secuencia de ADN del ADN aceptor de doble 10 cadena, y en el que dichos nucleótidos ocupan posiciones complementarias en el ADN aceptor de doble cadena