Moléculas de reconocimiento para el tratamiento y la detección de tumores.

Molécula de reconocimiento, caracterizada en que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

(i) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%,más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO. 1 o 2; y

(ii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%,más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO. 3 o 4; y

(iii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%,más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO. 5 o 6,

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e une de forma específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de la unión encomparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta almenos en un factor de 20.

Moléculas de reconocimiento para el tratamiento y la detección de tumores La invención se refiere a moléculas de reconocimiento que se dirigen contra tumores, composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de reconocimiento, procedimientos para la producción de las moléculas de reconocimiento y al uso de las moléculas de reconocimiento para la producción de una composición farmacéutica para el diagnóstico y la terapia de enfermedades tumorales.

Las enfermedades tumorales pertenecen a las enfermedades más frecuentes de organismos, en particular de mamíferos como los seres humanos. El tratamiento con éxito de la enfermedad tumoral depende en particular del estadio de desarrollo del tumor en el se empieza la terapia. Es ventajoso si se puede empezar la terapia en un momento, cuando el tumor muestra una expansión y difusión mínimas, entendiéndose por expansión el tamaño individual del tejido tumoral y por difusión la posible metástasis o infiltración en los órganos adyacentes. Un organismo que muestra una enfermedad tumoral, secreta determinadas sustancias complejas o moléculas más sencillas, que se pueden emplear para el diagnóstico de tumores en una fase temprana de la enfermedad – es decir, para tumores más pequeños. Las más conocidas de estas estructuras son marcadores tumorales. Los marcadores tumorales son generalmente sustancias químicas, que son más o menos específicas para un tipo de tumor determinado, o que aparecen aumentadas en asociación con un tumor. Los marcadores tumorales pueden, por ejemplo, ser de naturaleza celular, como por ejemplo oncogenes, determinados receptores de hormonas o antígenos de membrana, como por ejemplo CA 2, CA 3, CA 19-19 y otros. Los marcadores tumorales pueden, sin embargo, ser también marcadores humorales, que bien son producidos por el tumor o son inducidos por el tumor. Al grupo de los marcadores tumorales producidos por el tumor pertenecen en particular los antígenos, hormonas, enzimas y otros compuestos asociados a tumor. Los marcadores tumorales humorales inducidos por el tumor son, por ejemplo, enzimas, como la fosfatasa alcalina o por ejemplo la proteína de fase aguda (por ejemplo ferritina) . Puesto que los marcadores tumorales en el estado de la técnica preferiblemente se detectan con métodos inmunológicos, también se usa para los marcadores tumorales con frecuencia el sinónimo antígeno tumoral. Antígenos tumorales conocidos son antígenos oncofetales, antígenos asociados a los grupos sanguíneos, antígenos específicos de órgano y otros antígenos, como por ejemplo CA 15-3.

El diagnóstico del cáncer con marcadores tumorales con moléculas de reconocimiento muestra muchos inconvenientes. De esta manera determinados marcadores tumorales también pueden aparecer en enfermedades no cancerosas, por lo que las moléculas de reconocimiento establecidas muestran una reacción positiva; además una no interacción de la molécula de reconocimiento no significa que no está presente una enfermedad tumoral. Otro inconveniente es que las moléculas de reconocimiento conocidas, en general, son inespecíficas. Esto quiere decir que una prueba positiva sólo muestra de una forma segura un tipo específico de la enfermedad tumoral en casos poco frecuentes. Otro inconveniente, completamente decisivo de las moléculas de reconocimiento conocidas es además, que sólo se pueden usar condicionalmente para el seguimiento del desarrollo de tumores, por ejemplo tras una operación. Es decir, en general los marcadores tumorales conocidos no se pueden aplicar para la detección precoz o para el tratamiento posterior, especialmente no para profilaxis.

Junto a estos inconvenientes generales, se dan inconvenientes particulares para las moléculas de reconocimiento contra antígenos tumorales, que sólo se diferencian en su glicosilación de los correspondientes antígenos en tejidos normales. Los anticuerpos deben ser dependientes de glicosilación y reflejar el cambio en el estado de glicosilación del antígeno en el tumor. De esta manera por ejemplo la glicosilación de MUC1 cambia en células de tumor de mama. Muestra una fuerte reducción en la longitud de la cadena de O-glicano y una reducción en la O-acetilación del ácido siálico.

Un inconveniente más de las moléculas de reconocimiento conocidas contra marcadores tumorales es que sólo hacen reconocible el tumor cuando este ya alcanzado un tamaño crítico. Es decir, los primeros estadios del crecimiento del tumor no se pueden determinar con las moléculas de reconocimiento conocidas, que se dirigen contra marcadores tumorales.

La mucina polimoría epitelial MUC1 es como molécula completa un reconocido marcador tumoral. Price M. et al., Tumor Biology 1989, 19 (1) : 1-20 han descrito el análisis de una pluralidad de anticuerpos monoclonales contra la mucina MUC1. Debido a la complejidad de la molécula, que es muy grande, está fuertemente glicosilada, extracelular esencialmente compuesta de un gran número de polimorfos de repeticiones en tándem de 20 residuos de aminoácidos y respecto a las repeticiones en tándem está glicosilada de forma heterogénea, MUC1 posee una pluralidad de epítopos. Un inconveniente existente es, que no se sabe, qué epítopo de MUC1 como estructura diana es óptimo para la terapia y diagnóstico tumoral. Además es desventajoso, que los anticuerpos específicos de MUC1 convencionales (que producen un reconocimiento relativamente bueno de MUC1 en determinados tumores) también reconocen en alto grado tal MUC1 que se secreta de las células tumorales en el suero (shedding) . Esta alta unión a MUC1 presente en suero en los pacientes de tumores es obviamente un inconveniente en la terapia de enfermedades tumorales con tales anticuerpos específicos de MUC1. Un inconveniente adicional es, que la mayoría de los anticuerpos específicos de MUC1 también muestran unión a muchos tejidos normales.

El objeto de la invención es por lo tanto, preparar moléculas de reconocimiento, con las que se pueda detectar un tumor de forma fácil, segura y eficaz, y que además se puedan usar en la profilaxis, terapia y/o tratamiento de tumores y metástasis, y que no muestran ninguna o poca unión a MUC1 secretada en suero y que no muestran ninguna o poca unión a tejidos normales.

La invención resuelve este problema técnico a través de la preparación de moléculas de reconocimiento, 10 caracterizadas en que comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos:

(i) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferentemente el 70%, preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 o2; y

(ii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferentemente el 70%, preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3º4; y

(iii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferentemente el 70%,

preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 20 5º6,

y se unen de una manera específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado, de modo que la fuerza de la unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta en un factor de 20.

Las definiciones de los términos, que se hacen a continuación, son aplicables mutatis mutandis a las explicaciones previamente hechas, estas y las siguientes.

Mediante el término molécula de reconocimiento se entiende, según la invención, una molécula que, especialmente 30 en condiciones rigurosas, se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado. Las condiciones rigurosas son por ejemplo altas concentraciones de sal y lavados en exceso con detergentes suaves como NP-40 o Tween.

Mediante “epítopo tumoral MUC1 glicosilado” se entiende según la invención un epítopo que comprende al menos una secuencia PDTRP de las repeticiones en tándem de MUC1 y está glicosilado con GalNAc o Gal-GalNAc en la 35 treonina de PDTRP.

Mediante una unión específica del epítopo tumoral MUC1 glicosilado se entiende según la invención una unión de las moléculas de reconocimiento según la invención que comprenden una de las siguientes propiedades de unión:

a) Unión en ensayos como los descritos en el ejemplo 5 a la región PDTRP glicosilada dentro de una secuencia de repeticiones en tándem de MUC1, que comprende de 1 a 1, 5 repeticiones en tándem (molécula de 30 aminoácidos ver ejemplo 5) y que está glicosilada en treonina con GalNAcalfa1-O-Thr (denominada en lo siguiente como GalNAc) o Galbeta1-3GalAcalfa1-O-Thr (en lo siguiente como Gal-GalNAc) , estando... [Seguir leyendo]

1. Molécula de reconocimiento, caracterizada en que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

(i) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 o2; y

(ii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 o4; y

(iii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 o 6,

y se une de forma específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de la unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta al menos en un factor de 20.

2. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 1, caracterizada en que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

(i) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 7 u 8; y

(ii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 9 o10; y

(iii) una secuencia de aminoácidos, que tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, en especial preferiblemente el 90% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 11 o 12,

y se une de forma específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de la unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta al menos en un factor de 20.

3. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizada en que al menos un aminoácido de al menos una secuencia según SEQ ID NO: 1 a 12, se sustituye por un aminoácido con propiedades fisicoquímicas análogas y en que la molécula de reconocimiento se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta en al menos un factor de 20.

4. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada en que la secuencia SEQ ID NO: 1 o 2 se sustituye mediante una variante estructural canónica equivalente según las SEQ ID NO: 13 a 20 y/o al menos una secuencia de las secuencias SEQ ID NO: 3 o 4 se sustituye mediante una variante estructural canónica equivalente según las SEQ ID NO: 21 a 23 y/o al menos una secuencia de las secuencias SEQ ID NO: 7 u 8 se sustituye mediante una variante estructural canónica equivalente según las SEQ ID NO: 24 a 29 y/o al menos una secuencia de las secuencias SEQ ID NO: 11 o 12 se sustituye mediante una variante estructural canónica equivalente según las SEQ ID NO: 30 a 31 y en que la molécula de reconocimiento se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta en al menos un factor de 20.

5. Molécula de reconocimiento según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, caracterizada en que la cadena pesada variable VH y la cadena ligera variable VL están en diferentes cadenas polipeptídicas.

6. Molécula de reconocimiento según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, caracterizada en que la cadena pesada variable VH y la cadena ligera variable VL están unidas directamente entre sí en una proteína de fusión.

7. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada en que comprende una inmunoglobulina de los isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IgD y/o sus subclases.

8. Molécula de reconocimiento fusionada, químicamente acoplada, asociada de forma covalente o no covalente con uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con otra especificidad, fragmentos de anticuerpo de

cadena sencilla, multicuerpos, fragmentos Fab, proteína de fusión de un fragmento de anticuerpo con péptidos o proteínas derivados de una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la molécula de reconocimiento se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta en al menos un factor de 20.

9. Construcción, que comprende las moléculas de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada en que las moléculas de reconocimiento están fusionadas, acopladas químicamente o asociadas de forma no covalente con secuencias adicionales y/o estructuras.

10. Construcción según la reivindicación 9, caracterizada en que las moléculas de reconocimiento están fusionadas, químicamente acopladas, asociadas de forma covalente o no covalente con

(i) dominios de inmunoglobulinas de diferentes especies,

(ii) moléculas de enzimas,

(iii) dominios de interacción,

(iv) dominios para estabilización,

(v) secuencias señal,

(vi) colorantes fluorescentes,

(vii) toxinas,

(viii) anticuerpos catalíticos,

(ix) componentes citolíticos,

(x) inmunomoduladores,

(xi) inmunoefectores,

(xii) antígenos de MHC de clase I o clase II,

(xiii) quelantes para marcaje radioactivo,

(xiv) radioisótopos,

(xv) liposomas,

(xvi) dominios transmembrana,

(xvii) virus y/o

(xviii) células.

11. Molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de al menos una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una construcción según la reivindicación 9 o 10.

12. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, en donde un primer vector codifica la cadena pesada y un segundo vector la cadena ligera de una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o según una construcción según la reivindicación 9 o 10.

13. Casete de expresión o vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11 o 12 y un promotor que está operativamente unido con la molécula de ácido nucleico.

14. Célula huésped que comprende al menos un vector o un casete de expresión según la reivindicación 13.

15. Composición que comprende

(i) al menos una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

(ii) al menos una construcción según la reivindicación 9 o 10; y/o

(iii) al menos una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11 o 12.

16. Composición según la reivindicación 15, caracterizada en que, la composición es una composición farmacéutica, opcionalmente con un soporte y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.