VESICULAS LIOFILIZABLES SIN CRIOPROTECTOR.

La invención se dirige a la formación de vesículas cuya liofilización no requiere de crioprotectores, a su método de obtención y a procedimientos de liofilización y rehidratación de las mismas, así como su utilidad en diversos campos como, por ejemplo, el farmacéutico y el de sensores. Estado de la técnica La formación de vesículas nanométricas ha despertado el interés de la comunidad científica por las particulares propiedades derivadas de su tamaño. Los métodos conocidos para la preparación de vesículas son muy variados, por ejemplo, los descritos por Szoka y Papahadjopoulos, Ann. Rev. Biophysics bioeng. 9: 467-508 (1980). Numerosas propiedades como el tamaño de la vesícula, la polidispersidad, el potencial superficial, el grado de ionización, el comportamiento de fase termotrópico, la permeabilidad, la estabilidad física y otras dependen de la composición de la vesícula, pero puede variar en función del método de preparación. Para que las vesículas puedan ser utilizadas con fines comerciales, es deseable conseguir que su tiempo de vida medio se dilate al máximo para ser fácilmente manufacturadas, transportadas y almacenadas por los intermediarios y últimos usuarios. La estabilidad de las vesículas se define generalmente como el tiempo durante el cual una preparación dada mantiene su estructura y distribución de tamaños original. La inestabilidad puede ocurrir, por ejemplo, cuando la vesícula incrementa su tamaño espontáneamente como consecuencia de la fusión de vesículas colindantes. Esto es importante puesto que las propiedades, por ejemplo las propiedades farmacocinéticas in vivo, pueden depender del tamaño de las vesículas. En consecuencia, existen numerosas investigaciones para prolongar la estabilidad de las vesículas con fines de almacenamiento, entre las que puede destacarse la deshidratación, concretamente la liofilización. La liofilización es un proceso por el cual una sustancia se prepara en su forma seca por un rápido congelado y deshidratación en condiciones de alto vacío. Por ejemplo, en US 4,370,349 y US 4,397,34 se describen métodos para conservar vesículas utilizando técnicas de liofilización. El principal inconveniente que presentan en general los métodos de liofilización es que las vesículas requieren un protector (también llamado crioprotector) para evitar que la vesícula se agregue cuando se rehidrata, lo que conllevaría una modificación de su tamaño medio y, consecuentemente, de sus propiedades farmacológicas. Sustancias hidrofílicas tales como dextrano, manitol, lactosa y polivinilpirrolidona son bien conocidas en el campo de crioprotección para células y tejidos (Mackenzie, A. P. (1976) Develop. Boil. Standard 36, 51-67), así como para la liofilización de productos biológicos y farmacéuticos a granel (Mackenzie, A. P. (1966) Bull. Parenteral Drug Association 320, 101-129). También, en US 5,089,181 y US 5,817,334 se describe el uso de crioprotectores en procesos de liofilización de liposomas. A pesar de la adición de un crioprotector, después de liofilizar, su rehidratación provoca en las vesículas un cambio en el diámetro promedio con respecto a las vesículas originales. La recombinación de vesículas puede deberse a dos causas: (1) durante el proceso de enfriado, la transferencia de moléculas de agua a cristales de hielo incrementa la concentración en la disolución acuosa coexistente. Así, la separación entre las vesículas se reduce, lo cual incrementa la frecuencia de los posibles contactos intervesiculares y la probabilidad de procesos de recombinación, los cuales aumentan el tamaño medio; y/o (2) cuando el crioprotector se disuelve en la disolución y durante el proceso de enfriado, las vesículas se encuentran en un medio donde la concentración del crioprotector es extremadamente alta. Dado que las bicapas no son permeables a moléculas hidrofílicas grandes tales como suelen ser la mayoría de los crioprotectores, éstos quedan confinados en la disolución intersticial fuera de la vesícula. Esto produce un estrés osmótico sobre la vesícula, forzándola a adquirir una curvatura desfavorable, la cual puede ser liberada por procesos de recombinación, facilitando los mismos. En EP 1 293 248 se describen vesículas formadas a partir de calixarenos modificados para incorporar grupos amfifílicos (preparados por esterificación del hidroxilo en posición 2 con un grupo acilo de cadena larga). Aunque se dice que las vesículas formadas con los calixarenos modificados para incorporar grupos amfifílicos no requieren la adición de un crioprotector, la preparación de dichos calixarenos modificados resulta delicada, requiere estrictas condiciones anhidras y largos tiempos de reacción. Breve descripción de la invención En su esfuerzo continuado por preparar vesículas más estables, los inventores han conseguido preparar vesículas que son sorprendentemente más estables. 2 ES 2 360 027 A1 Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere una vesícula tal y como se define en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende uno o más surfactantes y uno o más calixarenos de fórmula (I) en donde R 1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3, alquinilo C2-C3; R 2 , R 3 y R 4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, sulfonato, alquilo C 1-C 20, alquenilo C 2-C 20, alquinilo C 2-C 20 y OR 6 ; en donde R 6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3, alquinilo C2-C3; R 5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C 1-C 6, alquenilo C 2-C 6, y alquinilo C 2-C 6; y n es un número entero que se selecciona de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Un segundo aspecto de la invención se refiere a un procedimiento tal y como se define en la reivindicación 11 para preparar dicha vesícula, caracterizado porque comprende proveer en agua al menos un calixareno de fórmula (I) y al menos un surfactante, preferiblemente aplicando sonicación. Un tercer aspecto se refiere a una vesícula obtenible por el procedimiento del segundo aspecto. Un cuarto aspecto se refiere a una vesícula, tal y como se define en el primer o tercer aspecto, liofilizada o rehidratada. Un quinto aspecto se refiere a un procedimiento que comprende la liofilización de una vesícula tal y como se ha definido en el primer o en el tercer aspecto. Un sexto aspecto se refiere al uso de una vesícula tal y como se define en el primer o en el tercer aspecto en un procedimiento de liofilización. Un séptimo aspecto de la invención es el uso de las vesículas tal y como se definen en el primer o en el tercer aspecto como sensores, sistemas de liberación controlada de sustancias biológicamente activas, tales como drogas o fármacos, o en la fabricación de productos cosméticos o en sistemas de conversión de energía solar fotoquímica. Un octavo aspecto de la invención es una composición, preferiblemente, una composición farmacéuticamente aceptable, que comprende una vesícula de la invención. Un noveno aspecto es una vesícula de la invención, o una composición que la comprende, para su uso como medicamento. Las vesículas de la invención se forman a partir de calixarenos comercialmente accesibles o fácilmente obtenibles. También los surfactantes utilizados son comercialmente accesibles o fácilmente obtenibles. En consecuencia, todo el procedimiento de obtención de la vesícula es sencillo y no requiere condiciones de reacción especiales. Las vesículas de la invención son más estables. Pueden ser deshidratadas, preferiblemente liofilizadas, y rehidratadas sin cambios en su diámetro medio, sin necesidad de añadir crioprotectores. Más aún, después de la deshidratación, preferiblemente liofilización, las vesículas se redispersan completamente en agua sin necesidad de sonicación. También se ha observado que las vesículas de la invención después de reidratadas no forman las fases lamelares observadas en otras vesículas. Incluso en algunos casos, las vesículas obtenidas son estables sin necesidad de liofilización, no habiéndose observado cambios en su estructura o propiedades después de hasta tres semanas. 3 Descripción detallada Componentes de las vesículas ES 2 360 027 A1 Los calixarenos son macrociclos u oligómeros cíclicos en los que la unidad que se repite es un anillo aromático sustituido por al menos un hidroxilo o un hidroxilo sustituido. Se conoce una gran variedad de calixarenos. Generalmente derivan de la hidroxialquilación de un derivado de fenol, como fenol resorcinol o pirogalol, con un aldehído, como formaldehído o acetaldehído. Métodos para su obtención se describen por ejemplo en a) Gutsche, C. D., Calixarene, Monographs in Supramolecular Chemistry, Vol 1, Stoddart J. F. Ed., The Royal Society of Chemistry, 1989; b) E. Da Silva, L. Memmi, A. W. Coleman, B. Rather... [Seguir leyendo]

1. Una vesícula caracterizada porque comprende uno o más surfactantes y uno o más calixarenos de fórmula (I) en donde R 1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3, y alquinilo C2-C3; R 2 , R 3 y R 4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste . en hidrógeno, sulfonato, alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20 y OR 6 ; en donde R 6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3, alquinilo C 2-C 3; R 5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, y alquinilo C2-C6; y n es un número entero que se selecciona del grupo que consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. 2. La vesícula según la reivindicación 1, en donde el calixareno es un calixareno de fórmula (II) en donde R 1 , R 2 , R 4 R 5 , R 6 y n son tal y como se han definido en la reivindicación 1. 3. La vesícula según la reivindicación 1 ó 2, en donde el calixareno es un calixareno de fórmula (III) en donde R 2 , R 4 R 5 y n son tal y como se han definido en la reivindicación 1, y R 1 es hidrógeno o metilo. 7 ES 2 360 027 A1 4. La vesícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde n es 4, 5, 6, 7 u 8. 5. La vesícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el calixareno se selecciona del grupo que consiste en p-sulfonatocalix[4]fenol, p-sulfonatocalix[6]fenol, p-sulfonatocalix[8]fenol, p-metoxicalix[4]bencenosulfonato, p-metoxicalix[6]benceno sulfonato, y p-metoxicalix[8]bencenosulfonato. 6. La vesícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el calixareno es soluble en agua. 7. La vesícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el surfactante es un tetraalquilamonio de fórmula R 7 [R 8 ][R 9 ][R 10 ]N+A , en donde cada R 7 , R 8 , R 9 y R 10 se selecciona independientemente del grupo de los alquilos C1-C30, y A es un contra-anión. 8. La vesícula según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el surfactante comprende dos o más cabezas iónicas. 9. La vesícula según la reivindicación 8, en donde el surfactante es un alquiliden-di[trialquilamonio] de fórmula A N+[R 8 ][R 9 ][R 10 ]-R 11 -[R 8 ][R 9 ][R 10 ]N+A , en donde cada R 8 , R 9 y R 10 se selecciona independientemente del grupo de los alquilos C 1-C 30, A es un contra-anión, y R 11 es un grupo alquiliden C 1-C 30. 10. La vesícula según la reivindicación 9, en donde el surfactante es un alquiliden-di [trialquilamonio] de fórmula A N+[R 8 ][R 9 ][R 10 ]-(CH2)p-[R 8 ][R 9 ][R 10 ]N+A , en donde cada R 8 , R 9 y R 10 se selecciona independientemente del grupo de los alquilos C 1-C 30, A es un contra-anión, y p es un número entero entre 1 y 30. 11. Procedimiento para preparar una vesícula, caracterizado porque comprende proveer en agua al menos un calixareno de fórmula (I), tal y como se define en la reivindicación 1, y al menos un surfactante, preferiblemente aplicando sonicación. 12. Una vesícula obtenible por el procedimiento definido en la reivindicación 11. 13. Una vesícula tal y como se define en las reivindicaciones 1-10 ó 12 liofilizada o rehidratada. 14. Una composición que comprende una vesícula tal y como se define en las reivindicaciones 1-10, 12 ó 13. 15. Procedimiento que comprende la liofilización de una vesícula tal y como se define en las reivindicaciones 1- 10, 12 ó 13, o una composición tal y como se define en la reivindicación 14. 16. Vesícula tal y como se define en las reivindicaciones 1-10, 12 ó 13, o una composición tal y como se define en la reivindicación 14 para su uso como medicamento. 17. Uso de una vesícula tal y como se define en las reivindicaciones 1-10, 12 ó l3 en un proceso de liofilización. 18. Uso de una vesícula tal y como se define en las reivindicaciones 1-10, 12 ó 13 como sensor, sistema de liberación controlada de sustancias biológicamente activas, tales como drogas o fármacos, o en la fabricación de productos cosméticos o en sistemas de conversión de energía solar fotoquímica. 8 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA