Una proteína aislada que comprende: (a) un dominio extracelular de HER-2/neu o un fragmento del domino extracelular,

en el que se han eliminado de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del domino extracelular; fusionado a: (b) un dominio de fosforilación de HER-2/neu o un fragmento del dominio de fosforilación de HER-2/neu, que comprende la SEC ID Nº: 5 o la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2, en el que la proteína puede producir una respuesta inmune en un animal de sangre caliente

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión de HER-2/neu, moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión de HER-2/neu, vectores virales que expresan proteínas de fusión de HER-2/neu y composiciones farmacéuticas (por ejemplo, vacunas) que comprenden las proteínas de fusión de HER-2/neu y/o moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de HER-2/neu. La presente invención también se refiere a procedimientos para tratar o prevenir el cáncer mediante la inducción o potenciación de una respuesta inmune a la proteína HER-2/neu, incluyendo para usos en el tratamiento de tumores malignos asociados con el oncogén de HER-2/neu.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

A pesar de enormes inversiones de recursos financieros y humanos, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, el cáncer es la principal causa de muerte en mujeres de edades comprendidas entre los 35 y 74 años. El cáncer de mama es el tumor maligno más común en mujeres y la incidencia del desarrollo de cáncer de mama está aumentando. Se estima que a una de cada nueve mujeres se le diagnosticará la enfermedad. Los enfoques convencionales para curar el cáncer de mama se han centrado alrededor de una combinación de cirugía, radiación y quimioterapia. Estos enfoques han dado como resultado algunos éxitos espectaculares en ciertos tumores malignos. Sin embargo, el cáncer de mama es con mayor frecuencia incurable cuando se diagnostica más allá de cierta fase. Son necesarios enfoques alternativos para el diagnóstico temprano y la terapia.

Una característica común de los tumores malignos es el crecimiento celular descontrolado. Las células cancerosas parecen sufrir un proceso de transformación del fenotipo normal a un fenotipo maligno capaz de crecimiento autónomo. La amplificación y sobreexpresión de genes celulares somáticos se considera un suceso primario común que da como resultado la transformación de células normales en células malignas. Las características fenotípicas malignas codificadas por los genes oncogénicos se pasan durante la división celular a la progenie de las células transformadas.

Se han identificado al menos cuarenta oncogenes operativos en células malignas y responsables de, o asociados con, la transformación. Estos oncogenes se han clasificado en diferentes grupos basándose en la supuesta función o en la localización de sus productos génicos, así como en la proteína expresada por el oncogén.

Se cree que los oncogenes son esenciales para ciertos aspectos de la fisiología celular normal. A este respecto, el oncogén de HER-2/neu parece ser un miembro de la familia tirosina quinasa de glucoproteínas de tipo receptor y comparte un alto grado de identidad con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). HER-2/neu supuestamente juega un papel en el crecimiento y/o diferenciación celular. HER-2/neu parece inducir tumores malignos a través de mecanismos cuantitativos que son resultado de una expresión aumentada o desregulada de un producto génico esencialmente normal.

La glicoproteína p185 es el producto proteico del oncogén de HER-2/neu. El gen de HER-2/neu se amplifica y p185 se sobreexpresa en una diversidad de cánceres, incluyendo cáncer de mama, de ovario, de colon, de pulmón y de próstata. p185 está relacionada con la transformación maligna y se encuentra en el 50-60% de carcinomas ductales in situ, en el 2040% de cánceres de mama invasivos, y en una fracción sustancial de adenocarcinomas que surgen en los ovarios, próstata, colon y pulmón. La expresión de HER-2/neu está íntimamente asociada, no sólo con el fenotipo maligno, sino también con la agresividad del tumor maligno. La sobreexpresión de HER-2/neu está relacionada con un mal pronóstico tanto en cánceres de mama como de ovario.

p185 es una proteína transmembrana con una masa molecular relativa esperada de 185 kD que tiene aproximadamente 1255 aminoácidos de longitud. p185 tiene un dominio extracelular (ECD) de aproximadamente 645 aminoácidos con al menos un 40% de identidad con EGFR, un dominio transmembrana altamente hidrófobo, y un dominio intracelular carboxiterminal (ICD) de aproximadamente 580 aminoácidos con al menos un 80% de identidad con EGFR.

Existe la necesidad de vacunas anticáncer que puedan dirigirse a un tumor maligno con el que el esté asociado el oncogén de HER-2/neu, y de composiciones y procedimientos que puedan inducir y potenciar una respuesta inmune contra el gen de HER-2/neu. La presente invención se refiere a éstos, así como a otros, fines importantes.

El documento WO90/14357 desvela el dominio extracelular de Her2 y vacunas que lo contienen.

El documento WO96/30514 desvela fragmentos adicionales de Her-2/neu que pueden ser útiles en el tratamiento de tumores malignos.

Diss y col (1996) J Immunol 156, 3151-3158 desvela que Her-2/neu es una proteína propia y que las ratas inmunizadas con el ICD o ECD de proteína neu de rata desarrollaron inmunidad de células T CD4+ e inmunidad de Ab contra péptidos y proteína neu de rata. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona proteínas de fusión de pal 85 de HER-2/neu, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de HER-2/neu, y vectores virales que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas de fusión de HER-2/neu, para usos que incluyen la inmunización de animales de sangre caliente frente a tumores malignos con los que está asociado el oncogén de HER-2/neu. Las proteínas de fusión o moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden estar presentes en composiciones que incluyen un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una emulsión de aceite en agua y, opcionalmente, incluyen uno o más principios activos adicionales, tales como una sustancia inmunoestimulante, por ejemplo, SBAS-2, 3DMPL, QS21, o una combinación de 3D-MPL y QS21. Las composiciones de la invención son útiles como, y pueden estar en forma de vacunas. Las proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, vectores virales, composiciones farmacéuticas y/o vacunas pueden administrarse una sola vez (por ejemplo, para un individuo con un alto riesgo de adquirir o readquirir un tumor maligno o cuando se sospeche la presencia un tumor maligno) o periódicamente (por ejemplo, para un individuo con un alto riesgo de adquirir o readquirir un tumor maligno o cuando se sospeche la presencia un tumor maligno). Los compuestos o composiciones de la presente invención son útiles en el tratamiento de uno o más tumores existentes o en la prevención de la aparición o reaparición de tumores, en animales de sangre caliente incluyendo seres humanos.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para inhibir o prevenir el desarrollo de un cáncer en un paciente mediante la inducción o potenciación de una respuesta inmune contra la proteína de HER-2/neu, que comprende la administración a un paciente de una composición farmacéutica o una vacuna como se ha relatado anteriormente. El paciente puede estar aquejado de, por ejemplo, cáncer de mama, de ovario, de colon, de pulmón o de próstata, en cuyo caso los procedimientos proporcionan tratamiento para la enfermedad, o un paciente considerado en riesgo de padecer dicha enfermedad puede tratarse profilácticamente. En una realización, la administración de la composición farmacéutica o vacuna comprende transfectar células de un animal de sangre caliente ex vivo con una molécula de ácido nucleico de la invención o infectar células de un animal de sangre caliente ex vivo con un vector viral, que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención y, posteriormente, suministrar las células transfectadas o infectadas al animal de sangre caliente.

La presente divulgación proporciona además, dentro de otros aspectos, procedimientos para eliminar células tumorales de una muestra biológica, que comprenden poner en contacto una muestra biológica con células T que reaccionen específicamente con una proteína de fusión de HER-2/neu, en los que la etapa de la puesta en contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la eliminación de células que expresan la proteína de la muestra. Dentro de los aspectos relacionados, se proporcionan procedimientos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una muestra biológica tratada como se ha descrito anteriormente.

En otra realización,...

1. Una proteína aislada que comprende:

(a) un dominio extracelular de HER-2/neu o un fragmento del domino extracelular, en el que se han eliminado de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del domino extracelular; fusionado a:

(b) un dominio de fosforilación de HER-2/neu o un fragmento del dominio de fosforilación de HER-2/neu, que comprende la SEC ID Nº: 5 o la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2, en el que la proteína puede producir una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.

2. Una proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

(a) un dominio extracelular de HER-2/neu o un fragmento del domino extracelular, en el que se han eliminado de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del domino extracelular; fusionado a:

(b) un dominio de fosforilación de HER-2/neu o un fragmento del dominio de fosforilación de HER-2/neu, que consiste en la SEC ID Nº: 5 o la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2.

3. Una proteína aislada seleccionada de:

(a) una proteína que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 6, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4;

(b) una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con la secuencia que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2;

(c) una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4;

(d) una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2;

(e) una proteína que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 7, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5;

(f) una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2;

(g) una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5; y

(h) una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2;

en la que la proteína es capaz de producir una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.

4. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 6, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4.

5. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína: comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con la secuencia que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2.

6. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4.

7. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2.

8. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 7, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5.

9. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2.

10. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5.

11. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2.

12. La proteína de cualquier reivindicación anterior, en la que el dominio extracelular de HER-2/neu se fusiona al dominio de fosforilación de HER-2/neu o fragmento del domino de fosforilación mediante un engarce químico.

13. La proteína de la reivindicación 12, en la que el engarce químico es un engarce de aminoácidos.

14. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 13.

15. Un vector viral que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 13.

16. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 14 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que la composición farmacéutica es una vacuna.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente una sustancia inmunoestimulante o un potenciador de la respuesta inmune.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en la que el potenciador de la respuesta inmune comprende: un adyuvante, microesferas biodegradables o liposomas.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en la que el adyuvante comprende AS-2; monofosforil lípido A; monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL); oligonucleótidos que contienen CpG; saponina; QS21; una combinación de QS21 y 3D-MPL; QS21 inactivado con colesterol; una combinación de una emulsión de aceite en agua y tocoferol; una combinación de QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua; ISCOMS; RC-529; o Aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGP).

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en la que proteína se presenta en una emulsión de aceite en agua.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la sustancia inmunoestimulante es SBAS2, 3D-MPL, QS21 o una combinación de 3D-MPL y QS21.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

24. Uso de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el ácido nucleico de la reivindicación 14, o el vector viral de la reivindicación 15, o células infectadas ex vivo con el

vector viral de la reivindicación 15, o células transfectadas ex vivo con el ácido nucleico de la reivindicación 14, para la fabricación de un medicamento para inducir o potenciar una respuesta inmune contra la proteína Her-2/neu.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el medicamento que contiene proteína

o ácido nucleico se administrará en forma de vacuna.

26. Uso de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el ácido nucleico de la reivindicación 14, o una célula presentadora de antígenos que expresa una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente.

27. El uso de la reivindicación 26, en el que la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.

28. El uso de la reivindicación 26 ó 27 en el que el cáncer es cáncer de mama, de ovario, de colon, de pulmón o de próstata.

29. Un procedimiento para eliminar células tumorales de una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto una muestra biológica con células T que reaccionan específicamente con una proteína de fusión de HER-2/neu, en el que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

(i) el polinucleótido de la reivindicación 14; y

(ii) complementarias de los polinucleótidos anteriores; en el que la etapa de contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la eliminación de las células que expresan el antígeno de la muestra, y en el que la muestra biológica es sangre o una fracción de la misma.

30. Un procedimiento para estimular y/o expandir in vitro o ex vivo células T específicas para una proteína de fusión de HER-2/neu, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto células T con: la proteína de las reivindicaciones 1 a 13; un polinucleótido que codifique dicha proteína de fusión; o una célula presentadora de antígenos que exprese dicha proteína de fusión.

31. Una población de células T aislada, que comprende células T preparadas de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 30.

32. Un procedimiento para generar una proteína de fusión de Her-2/neu de acuerdo con 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) introducir en una célula un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14;

(b) cultivar la célula transfectada; y

(c) purificar la proteína expresada.

33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que la célula es una de las siguientes células o líneas celulares: líneas celulares CV-1/EBNA, células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), COS, NS-1, HeLa, de fibroblastos de riñón embrionario humano (HEK 293) y BHK.

34. El procedimiento de la reivindicación 33, en el que la célula se cultiva en suspensión, en condiciones sin suero.

35. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que la proteína expresada se purifica por 20 un procedimiento de dos etapas, comprendiendo el procedimiento:

(a) cromatografía de intercambio aniónico en columnas de alto rendimiento de Q-sefarosa; y

(b) cromatografía hidrófoba en Phenyl Sepharose 6 Fast Flow de baja sustitución.